La ciclofilina D come bersaglio farmacologico: suoi potenziali inibitori peptidici

The mitochondrial permeability transition pore (MPTP) plays a key role in the process of mitochondria-mediated cell death (apoptosis). Molecules able to inhibit the MPTP can therefore be potential therapeutic agents useful in treating conditions such as trauma, ischemia/reperfusion injury, Parkinson's and Alzheimer's disease and in general all those conditions in which oxidative stress is involved and leading to apoptosis. The cyclophilin D (CypD), a peptidyl-prolyl isomerase, is a mitochondrial matrix protein that is closely involved in the open-closed transition regulation of MPTP. The mechanism by which exerts its action is not yet known. There are, however, evidence highlighting its key role in the modulation of mitochondrial permeability. Like other cyclophilin family members, is targeted by cyclosporin A (CsA), a cyclic undecapeptide extracted from the fungus Tolypocladium inatum, which has revolutionized the practice of preventing transplant rejection. In fact, CsA is well known for his powerful immunosuppressant that is expressed through the formation of a ternary complex with a cyclophilin and calcineurin (Cn), a Ser/Thr phosphatase, Ca2+/calmodulin-dependent. Cn, through the dephosphorylation of nuclear factor of activated T cells, is heavily involved in signal pathways that activate the immune response. CsA interacts with a cyclophilin and the CsA-Cyp complex associates with Cn, inhibiting its enzymatic activity. Gene ablation studies show that CypD desensitizes MPTP. In addition, treatment with CsA improves, through interaction with CypD and then MPTP inhibition, the conditions of various diseases related to mitochondrial dysregulation in animal models. All these findings validate the hypothesis that inhibition of CypD is a good therapeutic strategy. The major problem in the use of CsA as an inhibitor of CypD is its immunosuppressive action, which limits its use as may be given only for short periods of time. Indeed, preliminary clinical studies performed on patients with Ullrich dystrophy and Bethlem myopathy have yielded encouraging results, but in a few weeks, the patients became immunosuppressed, and then exposed to the potential risk of contracting dangerous infections. Another problem is that CsA, in spite of its lipophilicity, does not reach adequate concentrations in the central nervous system, particularly in the brain after systemic administration, because it fails to adequately penetrate the blood-brain barrier. In light of these considerations it is clear that CypD is a drug target of interest and obtaining ligands with no activity against the Cn and can reach high concentrations in the central nervous system, is a condition for the development of promising of therapeutic agents that can control a variety of disorders or diseases. Antamanide (Anta) is a non-toxic ciclodecapeptide isolated from the fungus Amanita phalloides. Much of the research conducted on this molecule have been devoted to the study of his activities in relation to its ability to form complexes with alkali metals and alkaline earth metals, mainly Na+ and Ca2+, which were then structurally and functionally studied. As CsA and ciclolinopeptide A, a ciclononapeptide extracted from flax seed, the Anta has some immunosuppressive activity, which is however lower than that of CsA. The purpose of this work is to design, chemical synthesis and characterization, with NMR, atomic interactions with the protein, of peptide inhibitors of CypD and more specifically of the Anta and its derivatives. The objective is to identify new ligands that are not immunosuppressive. The Anta has been chosen as the starting point for the features common to CsA, for the fact of having biological activity and the ability to chelate Ca2+ ions that play an important role in the regulation of MPTP. For this reason we synthesized the Anta and some derivatives in which the Phe residue at position 6 and 9 are replaced by either Gly and Tyr residues. We also synthesized two octapeptidies lacking the Phe in position 5 and 6, and the Phe in position 9 has been replaced by Gly and Tyr. Finally we got for expression in E. coli the CypD marked with 15N, to perform two-dimensional heteronuclear NMR experiments. However, the great difficulties encountered in the refolding of the protein did not allow us to obtain valuable information that this technique could offer. Peptides were performed on the in vitro biological assays, which have shown as the Anta is an inhibitor of the mitochondrial transition pore and that this action is via inhibition of CypD. We have also shown that Anta protects from mitochondrial depolarization and cell death. Finally we can say that the Phe 6 and 9 are essential for the biological action on CypD, as all its derivatives have shown no activity.

Il poro di transizione mitocondriale (MPTP) gioca un ruolo chiave nel processo di morte cellulare mediata dal mitocondrio (apoptosi). Molecole in grado di inibire il MPTP possono dunque essere dei potenziali agenti terapeutici, utili nel trattamento di patologie come il trauma, il danno da ischemia/riperfusione, le malattie di Parkinson e Alzheimer e in generale di tutte quelle condizioni in cui è coinvolto lo stress ossidativo e che portano all’apoptosi. La ciclofilina D (CypD), una peptidil-prolil isomerasi della famiglia delle ciclofiline, è una proteina della matrice mitocondriale che è strettamente implicata nella regolazione della transizione aperto-chiuso dell’MPTP. Il meccanismo con cui esplica la sua azione non è ancora conosciuto. Vi sono però delle evidenze che mettono in luce il suo ruolo fondamentale nella modulazione della permeabilità mitocondriale. CypD, così come altri membri della famiglia delle ciclofiline, è il bersaglio principale della ciclosporina A (CsA), un undecapeptide ciclico estratto dal fungo Tolypocladium inatum, che ha rivoluzionato la pratica dei trapianti prevenendo le reazioni di rigetto. CsA infatti è ben nota per la sua potente azione immunosoppressiva che si esplica mediante la formazione di un complesso ternario con una ciclofilina e la calcineurina (Cn), una Ser/Thr fosfatasi Ca2+/calmodulina dipendente. Cn, attraverso la defosforilazione del fattore nucleare di attivazione delle cellule T, è fortemente coinvolta nelle vie del segnale che attivano la risposta immunitaria. CsA complessa con una ciclofilina e il complesso CsA-Cyp si associa con Cn, inibendone l’attività enzimatica. Studi di ablazione genica della CypD mostrano un’inibizione della permeabilità mitocondriale. Inoltre il trattamento con la CsA migliora, attraverso l’interazione con CypD e quindi l’inibizione dell’MPTP, le condizioni di diverse patologie legate alla disregolazione mitocondriale in modelli animali. Tutte queste evidenze convalidano l’ipotesi che inibire CypD sia una buona strategia terapeutica. Il maggior problema inerente all’uso di CsA come inibitore di CypD è la sua azione immunosoppressiva, che ne limita l’impiego in quanto è possibile somministrarla solo per brevi periodi di tempo. Infatti studi clinici preliminari effettuati su pazienti affetti da distrofia di Ullrich e miopatia di Bethlem hanno dato risultati incoraggianti, ma in poche settimane i pazienti sono diventati immunodepressi e quindi esposti al rischio potenziale di contrarre pericolose infezioni. Un altro problema è che la CsA, nonostante la sua lipofilia, non raggiunge adeguate concentrazioni nel sistema nervoso centrale, in particolare nel cervello, dopo somministrazione sistemica, in quanto non riesce a permeare adeguatamente la barriera emato-encefalica. Alla luce di queste considerazioni appare chiaro che la CypD sia un bersaglio farmacologico di grande interesse e che l’ottenimento di ligandi privi di attività nei confronti della Cn e in grado di raggiungere concentrazioni elevate nel sistema nervoso centrale, sia una condizione promettente per lo sviluppo di agenti terapeutici in grado di controllare una gran varietà di disturbi o patologie. Un altro peptide ciclico con struttura riconducibile alla CsA è l’antamanide (Anta). L’Anta è un ciclodecapeptide non tossico isolato dal fungo Amanita phalloides. Molte delle ricerche condotte su questa molecola sono state rivolte allo studio della sua attività in relazione alla sua capacità di formare complessi con metalli alcalini e alcalino-terrosi, principalmente Na+ e Ca2+, che sono poi stati studiati da un punto di vista strutturale e funzionale. Come la CsA e il ciclolinopeptide A, un ciclononapeptide estratto dai semi di lino, l’Anta possiede una certa attività immunosoppressiva, che risulta però inferiore a quella della CsA. Lo scopo di questo lavoro è l’ideazione, la sintesi chimica e la caratterizzazione, mediante NMR, delle interazioni atomiche con la proteina, di inibitori peptidici della CypD e più specificatamente dell’Anta e suoi derivati. L’obiettivo è quello di identificare nuovi ligandi che non risultino immunosoppressivi. L’Anta è stata scelta come base di partenza per le caratteristiche comuni alla CsA, per il fatto di avere un’attività biologica intrinseca e per la capacità di chelare ioni Ca2+ che giocano, anch’essi, un ruolo importante nella regolazione dell’MPTP. Per questo motivo abbiamo sintetizzato l’Anta e alcuni suoi derivati in cui i residui di Phe in posizione 6 e 9 sono sostituiti alternativamente da residui di Gly di Tyr. Inoltre abbiamo sintetizzato due ottapeptidi in cui mancano le Phe in posizione 5 e 6 e in posizione 9 la Phe è stata sostituita da Gly e Tyr. Infine abbiamo ottenuto per espressione in E. coli la CypD marcata al 15N, così da poter effettuare esperimenti NMR bidimensionali eteronucleari. Tuttavia, le notevoli difficoltà riscontrate nel refolding della proteina non ci hanno permesso di ottenere le preziose informazioni che questa tecnica poteva offrire. Sui peptidi sono stati effettuati comunque dei saggi biologici in vitro, che hanno dimostrato come l’Anta sia un inibitore del poro di transizione mitocondriale e che questa azione si esplica attraverso l’inibizione della CypD. Inoltre abbiamo dimostrato che protegge dalla depolarizzazione mitocondriale e dalla morte cellulare. Infine possiamo affermare che le Phe 6 e 9 sono fondamentali per l’azione biologica su CypD, poiché tutti i suoi derivati si sono mostrati privi di attività.