Studio del proteoma del seme congelato equino mediante elettroforesi bidimensionale

Proteomics to evaluate the effect of cryopreservation on post-tahw stallion sperm OBJECTIVES AND METHODS The success of cryopreservation in stallion sperm is lower than bull (1). Stallions are commonly selected on the basis of athletic performance records, pedigree and conformation. “Freezability” of semen is a term used to indicate survival rates of sperm populations after a freezing-thaw cycle on the basis of motility parameters. About 20-50% of stallions have sperm with unacceptable freezability (2) and a a lot of variations inter- ad intra stallion also exist, altoughth many different extenders were tested to improve quality of frozen semen. The aim of this study was to compare by proteomic analysis sperm protein expression profile from 6 stallions as studs. They were selected in groups of “high” or “low” freezability quality, according to WBFSH (World Breeding Federation for Sport Horses) guideline ( 35% minimum of PMS, Progressive Motile Spermatozoa). Whole sperm proteins were extracted by 0,5 mL commercial paillettes of frozen semen. After centrifugation cycles to remove extender (INRA82 with abundant skim milk powder declared) protein extracts by 2 commercial paillettes for each stallion were loaded on 7 cm immobilized pH gradient (4-8) IPG strip and separated by IEF (Iso Electro Focusing) as the first dimension, and then with upright SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) as the second. Every analisys were repeated in double. A usefull method to eliminate extender’s caseine was carried out to avoid interference with semen protein focalisation around pI 4. RESULTS Comparative proteomics analysys of all gels by imagine analysis software showed that expression of 10 protein spots (fig. 1) is related to high or low freezability parameters. Spots 25,27,18 are similar to sp32 (proacrosin binding protein, 28-29kDa, pI 4.8-5.2, teorical 61kDa, 5.9 pI), implicated in acrosomial reaction. In gels appears as a triplette of spots at the same pI, maybe to indicate post-translational modifications. Spot 12 is similar to CRISP3 (Cysteine-rich secretory protein) seminal plasma protein specific to stallion sperm and positively related to fertility (3). Spots 17 and 23 are similar to kallicrein-1E2 (KLK2), protein isoforms, negatively related to prengnancy rate and positively related to ejaculate volume (3). Spots 31 and 32 are highly expressed in “good” freezer stallions, and are compatible with aSFP (acidic protein bovine seminal plasma, 11-12 kDa pI 4.9), a protein of boar seminal plasma spermadhesine, and may play a role against ROS (reactive oxygene species). Spot 68 and 30 can be similar to bovine BSP A1/A2 (16 kDa, pI 4.7-5.5) also called PDC-109, a bull heparin-binding proteins of the seminal plasma positively correlated with good freezeability in this species (4). CONCLUSION Comparative proteomics analysis i this study showed that the expression levels of several proteins are related to high or low semen freezability. Some of that proteins are seminal plasma proteins, and we could hypotithesize that they are involved in protection sperm during cryoconservation and in preservation against oxidative damage. This study also confirme that mere knowledge of the gene sequences is insufficent to elucidate biochemical changes in sperm function, expecially related to post-traslational protein modifications. This study also demonstrate that 2-DE is a crucial step in the workflow of a proteomic approach, and the importance of a correct method to extraction proteins from semen frozen with addicted extender, instead of usual methods based on standard tissues protocols. Further large-scale proteomic studies will lead to the development of novel biomarkers of good semen freezabilty, essential to abtain higher and easier reproductive efficiency and to ansure lower cost and time-loss by breeders.

INTRODUZIONE – Con il miglioramento delle biotecnologie inerenti l’inseminazione artificiale (IA), la conservazione e il trasporto del materiale seminale, il potenziale riproduttivo maschile ha assunto un’importanza spiccata in termini zootecnici e commerciali. Nel cavallo la selezione degli stalloni impiegati come riproduttori si basa soprattutto alla valutazione delle performance sportive e delle caratteristiche morfofunzionali dell’animale. Attualmente il valore riproduttivo di uno stallone è basato essenzialmente su parametri seminali classici (concentrazione, motilità progressiva e totale, morfologia, numero totale di spermatozoi), benché sia ormai noto che tale valore è il risultato di complesse interazioni di tipo genetico, ambientale e biologico. Il valore riproduttivo degli stalloni non è al momento quantificabile, come accade invece nel bovino, mediante l’assegnazione di un Indice genetico Quantitativo basato su test di progenie, e i dati sull’Indice di Fertilizzazione (percentuale di concepimento per ciclo ovulatorio) sono sporadici, soprattutto in seguito all’utilizzo di seme congelato. E’ noto infatti che la crioconservazione attiva reazioni ossidative e riduce il tempo di sopravvivenza degli spermatozoi post-scongelamento. Rispetto alla specie bovina inoltre la qualità del seme congelato equino è molto inferiore, e solo il 20-50% degli stalloni hanno parametri seminali accettabili dopo lo scongelamento (1). Esistono poi forti variazioni inter- e intra- individuali nella congelabilità del seme degli stalloni non ancora chiarite con le convenzionali analisi del seme (2). Si è iniziato a parlare di proteomica dello sperma nel 1997, e da allora alcuni studi sono stati condotti sull’uomo (3,4,5) e su varie specie animali (6,7,8,9). Il vantaggio offerto dalla proteomica è quello di avere in una sola separazione elettroforetica bidimensionale un quadro completo delle proteine espresse in un preciso momento da un dato comparto cellulare di un individuo. L’obiettivo di questo lavoro è l’analisi proteomica di campioni di seme congelato di stalloni con caratteristiche seminali differenti post-scongelamento. MATERIALI E METODI - Il seme congelato di 4 stalloni raccolto presso un Centro di Riproduzione Equina riconosciuto (Intermizoo spa, Vigonza, PD), è stato sottoposto ad analisi elettroforetiche bidimensionali. 4 paillettes commerciali sono state analizzate per ogni stallone, di cui si conoscono i valori relativi alla concentrazione, motilità totale (MOT) e spermatozoi progressivamente motili (PMS) post-scongelamento, calcolate mediante dispositivo computerizzato CASA (Computerized Assisted Sperm Analyzer) (Hamilton Thorne®, Biosciences). In accordo con le linee guida della WBFSH (world breeding federation for sport horses), che stabilisce come standard minimo di utilizzo del seme congelato un valore di 35% di PMS, i soggetti analizzati sono stati inquadrati come“good” (campione 6 e 7) e “bad” freezer (campione 3 e 5). Il pellet cellulare ottenuto dopo 5 cicli di centrifugazione (2000G per 20’) è stato risospeso in 800 µL di tampone di estrazione (7 M urea, 2 M Tiourea, 4% Chaps, 1% DTT) e poi sonicato (5 cicli, in ghiaccio). Dopo centrifugazione (2000G per 5’) al fine di eliminare i residui cellulari, le proteine di ciascun campione sono state quantificate mediante 2D QuantiKit® (BioRad). E’ stata poi eseguita l’isoelettrofocalizzazione su strip non lineari a gradiente di pH immobilizzato (range 4-8) da 7 cm (10), mediante IPGphor II® (GE Healtcare) fino al raggiungimento di 70KV/h totali. Dopo equilibrazione, le strip sono state trasferite su gel (SDS-PAGE 12,5% acrilamide) per la separazione in seconda dimensione su Mini Protean 2D cell® (Biorad). I gels ottenuti sono stati poi colorati utilizzando un protocollo standard di colorazione con Coomassie colloidale (11), e digitalizzati per l’analisi d’immagine degli spot con software dedicati. RISULTATI - Sono stati identificati 124 spot. L’analisi comparativa ha evidenziato numerose differenze inter-individuali. Alcuni spot differentemente espressi tra i diversi campioni sono stati identificati mediante ricerca bibliografica di mappe proteomiche esistenti in altre specie (4,6,7,8,9,12), in attesa di ulteriori analisi mediante spettrofotometria di massa (Fig.1). DISCUSSIONE - Gli spot 18, 25 e 27 potrebbero corrispondere alla sp32 (proacrosin binding protein, 28-29kDa, pI 4.8-5.2) proteina implicata nella capacitazione e ben conservata tra le specie. Nei gels tale proteina appare sottoforma di una catena di tre spot con punti isolettrici lievemente dissimili, ad indicare probabilmente modificazioni post-translazionali (12) quali la fosforilazione che avviene alla capacitazione. Lo spot 12 sembrerebbe corrispondere alla CRISP3 (cysteine-rich secretory protein), 25 kDa, pI 7,54), proteina specie specifica del plasma seminale equino e correlata positivamente alla fertilità (8). Gli spot 17 e 23 corrisponderebbero alle isoforme della kallicreina (27 kDa pI 5.51), correlate negativamente alla fertilità nello stallone (8). Gli spots 31 e 32 sembrano essere simili alla aSFP (acidic protein bovin seminal plasma, 11-12 kDa pI 4.9), appartenente alla famiglia delle spermadesine (6), avente ruolo di protezione della membrana spermatica dalla perossidazione lipidica indotta dai ROS (reactive oxygen species) e risultata associabile ad una migliore congelabilità nel seme di toro (7). Gli spot 30 e 68, potrebbero corrispondere alla BSP A1/A2 bovina (16 kDa, pI 4.7-5.5) detta anche PDC109, proteina del plasma seminale che si lega specificatamente ai fosfolipidi di membrana degli spermatozoi. La sua abbondanza nel plasma seminale dei tori con buona congelabilità, induce a ipotizzare che abbia un ruolo determinante nella protezione della membrana spermatica durante le procedure di crioconservazione (7). Questi dati confermano che la proteomica può essere di notevole ausilio in andrologia, in quanto gli spermatozoi sono cellule altamente specializzate, con una membrana molto complessa e ricca in proteine, e subiscono forti modificazioni del corredo proteico nel corso della maturazione. Inoltre, a causa del complesso riarrangiamento del DNA e dell’estrusione di gran parte del citoplasma, sono cellule dalle limitate difese contro i ROS (reactive oxygen species). E’ noto che la manipolazione e i metodi di crioconservazione amplificano gli effetti deleteri dei ROS sul seme. Un’accurata indagine proteomica potrebbe svelare modificazioni a carico del corredo proteico indotte da alti livelli di ROS nel seme. L’utilizzo di questa tecnica elettroforetica potrebbe inoltre permettere lo studio delle modificazioni dei parametri seminali allo scongelamento utilizzando protocolli diversi di crioconservazione. Infine l’identificazione di ulteriori spot con diversa espressione e la correlazione con parametri seminali e dati sulla fertilità potrebbero consentire l’individuazione di biomarkers predittivi del potenziale riproduttivo degli stalloni e la messa a punto di test di screening.