Fungi associated with the pine engraver beetle Ips acuminatus and their interactions with the host tree

Conifer bark beetles are typically associated with complexes of fungi with which they can display different functional relationships. Some of the fungi, generally non phytopathogenic, are known to have a directly mutualistic interaction with the beetles, serving as nourishment to the larvae. Other associated fungi are thought to be involved in the process of exhausting plant defenses, which is a necessary step for the insects to overcome host tree resistance and colonize the plant. In the latter case, bark beetle-associated fungi are often tree pathogenic species belonging to the morphologically homogenous group of the ophiostomatoid fungi, also referred to as ‘blue-stain’ fungi. In spite of the great interest the bark beetle-fungi symbiosis has gained in time, many fundamental aspects of this relationship are still widely debated, as for instance the degree of dependence of bark beetles on the blue-stain fungi in order to succeed their establishment in the host plant. In this thesis I addressed the fungal community associated with the pine engraver beetle Ips acuminatus (Gyll.), a small bark beetle infesting thin bark of Scots pine (Pinus sylvestris L.) and that has been recently reported as pest in many alpine forests. I. acuminatus associated fungal community includes the obligate nutritional fungus Hyalorhinocladiella macrospora (Franke-Grosm.) Harr. and a specific blue-stain fungus which is consistently associated with the vector, but which identity is still uncertain. Early reports describe it as Ophiostoma clavatum Math.-Käärik, while a later research reported O. brunneo-ciliatum Math. instead. Objectives of the thesis were to determine the identity of the blue-stain fungi associated with I. acuminatus, and to investigate the fungal community interactions with the host plant, in order to better define the functional relationships occurring between the bark beetle and the associated fungi, and therefore contribute to the attempts in understanding ecology and population dynamics of this damaging species. In the first work a blue-stain fungus associated with I. acuminatus specimens collected in Italy and Sweden was isolated and identified. The identification of the species was achieved with both the support of morphological methods and DNA sequence-based methods, and the species resulted to be O. clavatum, in agreement with the first researches focused on I. acuminatus associated fungi. In the second work, to clearly assess which of the previously described Ophiostoma species was the main blue-stain fungus associated with the pine engraver beetle, three loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays were developed and employed in a survey which has covered six Italian populations of I. acuminatus. The results confirmed that the identity of the blue-stain fungus more consistently associated with I. acuminatus in the Italian Alps is O. clavatum, while O. brunneo-ciliatum was not detected in any of the samples. Results of this study showed also that the occurrence of O. clavatum varies accordingly to the population dynamic phase of the vector, and is slightly lower in the outbreak populations. In the third work, the local and systemic defense responses of Scots pine against both the nutritional and the blue-stain fungi were characterized by identifying and quantifying terpenoids, phenolic compounds, and lignin. Results indicated that Scots pine has a generic, rather than specific, induced response. The fact that the nutritional and the blue-stain fungi triggered comparable induced defense responses suggests that even a non-pathogenic fungus may participate in exhausting host plant defenses, indirectly assisting in the beetle establishment process. This finding contributes to the further development of current theories on the role of associated fungal complexes in bark beetle ecology. In the last work, correlation patterns within constitutive defense secondary metabolites of Scots pine and potential trade-offs between constitutive concentration and inducible variation of individual chemical compounds were tested. Results revealed that different compounds display different behaviors, but no overall negative associations between defensive traits were found. On the whole, the four contributions of this thesis provide suggestions for a revaluation of one of the current theories on the role of associated fungi in bark beetles host establishment, and hints to understand the role of associated fungi in the population dynamics of bark beetles. Moreover, they clarify some aspects of Scots pine defense mechanisms, highlighting its competitiveness.

Gli scolitidi delle conifere sono insetti spesso associati ad un complesso di funghi con i quali possono instaurare differenti interazioni ecologiche. Alcuni di questi funghi, generalmente non fitopatogeni, sono coinvolti in un’interazione mutualistica diretta e vengono utilizzati come nutrimento per le larve del vettore. Altri funghi associati, invece, sono ritenuti coinvolti nel processo di esaurimento delle difese della pianta, che per l’insetto è uno dei passaggi necessari per superare la resistenza dell’ospite e poterlo quindi colonizzare. In quest’ultimo caso, i funghi associati sono di norma specie patogene appartenenti al gruppo morfologico dei funghi ophiostomatoidi, noti anche come ‘funghi di azzurramento’. Nonostante l’interesse che la simbiosi tra scolitidi e funghi ha riscosso nel tempo, molti degli aspetti fondamentali di questa interazione sono ancora discussi, come ad esempio il grado di dipendenza degli insetti vettori dai loro simbionti nelle fasi di colonizzazione della pianta ospite. In questa tesi è stata presa in considerazione la comunità fungina associata a Ips acuminatus (Gyll.), un piccolo scolitide che attacca di preferenza le parti del tronco del pino silvestre (Pinus sylvestris L.) con corteccia sottile, e che di recente ha causato numerose infestazioni in varie zone distribuite sull’arco alpino. Una delle specie che fanno parte della comunità fungina associata ad I. acuminatus è il simbionte alimentare Hyalorhinocladiella macrospora (Franke-Grosm.) Harr. Fa inoltre parte del complesso anche uno specifico fungo di azzurramento costantemente associato al vettore, ma la cui identità non è ancora ben definita. Le prime segnalazioni lo descrivono come Ophiostoma clavatum Math.-Käärik, mentre ricerche successive riportano O. brunneo-ciliatum Math. Gli obiettivi che questa tesi si è prefissa sono stati determinare l’effettiva identità del fungo di azzurramento associato ad I. acuminatus, ed indagare le interazioni del complesso fungino con la pianta ospite, al fine di definire meglio le relazioni che intercorrono tra scolitidi e fungi associati, e poter quindi contribuire ai tentativi di chiarire l’ecologia e la dinamica di popolazione di questo insetto dannoso. Nel primo lavoro sono stati descritti l’isolamento e l’identificazione di una specie fungina isolata da individui di I. acuminatus raccolti in Italia e in Svezia. L’identificazione della specie è avvenuta sia grazie all’osservazione delle caratteristiche morfologiche sia mediante un approccio di tipo molecolare. La specie è risultata essere O. clavatum, come era stato indicato nelle prime segnalazioni riguardanti i funghi associati ad I. acuminatus. Nel secondo lavoro sono stati descritti la messa punto e l’utilizzo di tre sonde molecolari per loop-mediated isothermal amplification (LAMP), con l’obiettivo di determinare quale delle due specie del genere Ophiostoma sopracitate fosse effettivamente il fungo maggiormente associato a I. acuminatus nell’arco alpino. I risultati, riguardanti sei popolazioni italiane dell’insetto, hanno confermato che la specie maggiormente presente è O. clavatum, mentre O. brunneo-ciliatum non è mai stata rilevata. I risultati di questo studio hanno mostrato anche che la frequenza di associazione di I. acuminatus con O. clavatum varia a seconda della fase epidemica, ed è minore nei nuclei di infestazione rispetto alle popolazioni endemiche. Nel terzo lavoro sono state caratterizzate le risposte sia locali sia sistemiche del pino silvestre alla colonizzazione da parte del simbionte alimentare e del fungo di azzurramento, identificando e quantificando alcuni metaboliti secondari, come terpeni, fenoli e lignina. I risultati hanno mostrato che il pino silvestre risponde in maniera generica anziché specifica all’induzione. Il fatto inoltre che il simbionte alimentare e il fungo di azzurramento abbiano stimolato una risposta simile di loro suggerisce che anche un fungo non patogeno possa partecipare al processo di esaurimento delle difese della pianta, assistendo quindi l’insetto nelle fasi di colonizzazione dell’ospite. Questo risultato contribuisce quindi allo sviluppo delle attuali teorie sul ruolo dei funghi associati nell’ecologia degli scolitidi. Nell’ultimo lavoro sono state studiate le correlazioni tra i metaboliti secondari delle difese costitutive del pino silvestre, e le correlazioni tra la concentrazione costitutiva e la variazione indotta dei singoli composti. I risultati hanno messo in evidenza una differenziazione di comportamento tra composti e l’assenza in generale di una correlazione inversa tra i tipi diversi di difese, al contrario di quanto previsto da alcune teorie. Nel complesso, i quattro contributi di questa tesi suggeriscono la rivalutazione di una delle attuali teorie sul ruolo dei funghi associati nella colonizzazione dell’ospite da parte degli scolitidi, e forniscono degli spunti per la comprensione del ruolo dei funghi associati nella dinamica di popolazione del vettore. Chiariscono inoltre alcuni degli aspetti dei meccanismi di difesa del pino silvestre, mettendo in evidenza la sua competitività.