Auto-assemblaggio di nano-sistemi catalitici a base di peptidi e nanoparticelle d'oro.

The catalytic efficiency, mechanistic pathways, and structural complexity displayed by enzymes make them a tremendous source of inspiration for chemists involved in catalyst development[1, 2]. Nature has evolved enzymes as large multi-kilodalton complex structures in which even units that are remote from the actual active site may profoundly affect the activity of the enzyme[3]. The much lower complexity of artificial enzyme mimics may be an important reason for their typical modest performances with respect to enzymes. This awareness has led to an interest in catalysts based on multivalent scaffolds, such as dendrimers[4], micelles[5], and nanoparticles[6], with the idea of increasing the structural complexity of the synthetic system. A key challenge is straightforward access to synthetic catalysts that can match up to the size and complexity of enzymes. The necessity for multistep synthesis can be overcome by relying on self-assembly for the formation of the multivalent structure. In particular, the self-assembly of catalytic monolayers on the surface of gold nanoparticles (AuNPs) to give gold monolayer-protected clusters (AuMPCs) is emerging as an attractive strategy[7, 8]. Nonetheless, although they rely on self-assembly, the composition of self-assembled monolayers (SAMs) on Au NPs is typically still of rather low complexity[9]. Varying the surface composition by thiol clustering is a very difficult approach because this does not give a full control over the final composition, requires purification of each single NP system, and suffers from issues related to the characterization of mixed SAMs both in terms of composition and morphology. As a consequence, enormous efforts should be done to purify the different species coming from the synthesis. For that reason, in the recent years a new approach emerged by using nanoparticles not as direct tools, but as scaffolds to bind secondary molecules on. Rotello and coworkers were the first to realize this pioneering idea showing the attractiveness of cationic Au MPCs as a construction element for the development of innovative biosensors[10]. Inspired by those contributions, Prins et al. recently started to study the formation of heterofunctionalized multivalent structures relying on the self-assembly of small anionic peptides on the surface of Au MPCs[11, 12]. The results showed that it is possible to control the peptide surface composition simply exploiting the different affinities for the cationic monolayer. As a consequence, the low complexity of the surface can be overcome. This concept has been further developed during the PhD-project[13]. Based on the self-assembly of oligo-anions on a cationic surface, we went beyond the simple surface composition control and developed a true supramolecular nanoenzymatic system. It is composed by two fundamental elements: 1. Gold nanoparticles functionalized by alkyl thiols featuring a Trimethylammonium group in the Ω-position (8-Trimethylammonium octylthiol  NR4+-AuNPs) thus generating a cationic surface; 2. Anionic oligopeptides that bind the nanoparticles’ surface. These feature a C-terminal tail with three Aspartic acid residues; an N-terminal tail composed by a variable number of Histidines (H0-H3); a central Tryptophane residue linking the two edges (Ac-HnWDDD-OH). The four negative charges coming from the C-terminal tail give an efficient binding, while Histidine and Tryptophane allow, respectively, catalysis and signal output for peptide concentration and binding measurements. Both of these constitutional elements are inefficient catalysts by themselves. Only when the peptides self-assemble on the cationic surface an active system is formed, which is able to accelerate the hydrolysis of N-CBz-(D)Phe-ONP by two orders of magnitude over the background. Importantly, the multivalent surface plays a crucial role in tuning the catalytic activity. The surface not only brings the substrate and catalyst in close proximity but also generates a microenvironment with an enhanced local pH that further activates the catalytic peptide. Given the supramolecular nature of the whole system and considering what has been written about the fine regulation of the surface composition, this system is highly adjustable simply by modulating the concentration of the constitutional elements that self-assemble on the surface. Once we obtained the lead system we started to investigate the intrinsic features that characterized it like the importance of the chemical structure of the substrate, the peptide catalyst and the cationic surface. The sequence of the peptide catalyst is very important for the efficiency of the catalytic system. Mutations on the H1 sequence (Ac-HWDDD-OH) altering its order and length showed that Triptophane has a subsidiary role in binding and its position should be next to the C-terminal tail. Histidine should occupy the N-terminal position because the presence of other residues in such position would reduce the catalytic efficiency of the Imidazole residue. If the sequence is extended by insertion of a Glycine residue between the Tryptophane and the C-terminal tail, we still observe a lower hydolysis rate, but not so drastic as the one observed by flipping the N-terminal sequence (steric hinderance). Like a natural enzyme, this system has specific requirements for the substrate that undergoes hydrolysis. SAR studies have been performed on substrate analogs with different Nα-protecting groups and side chains. The results showed that large and hydrophobic substrates have a higher affinity for the nanoparticles and are hydrolyzed faster. This is presumably due to interactions between those hydrophobic surfaces and the hydrophobic part of the monolayer. The aromatic substrates are favoured respect to the alkyl ones which emerges from the comparison between the kobs of N-CBz-Leu-ONP and N-CBz-(L)Trp-ONP: the latter is hydrolyzed much faster. The Nα-protecting group seems to have a crucial role in the substrate stabilization: diminishing its dimensions, thus diminishing hydrophobicity, results in a fast, spontaneous hydrolysis in simple buffer. A significant effort was made to improve the catalytic performances of the system through a supramolecular approach. In particular a hybrid system was prepared by self-assembling peptide H2 (Ac-HHWDDD-OH) and a library of non-catalytic peptides contemporarily on the monolayer surface (Ac-XXWDDD-OH, where XX are Leu, Phe, Ser and Arg in 42 possible combinations). The idea was that the second peptides would modulate the catalytic efficiency of the system. The results did not match the expectations which is presumably due to the fact that those peptides did not compensate the loss of the pH effect with additional interactions. Mutations on the H1 sequence (Ac-HWDDD-OH) by inserting identical flanking residues beside Histidine (Ac-XHXWDDD-OH) were studied with the scope of generating enantioselectivity. Although the variety of the flanking residues was large, (Leu, Phe, Ser, Tyr) no substrate enatioselectivity was observed. Despite this we had some experimental evidences that suggested that some enantioselectivity could be obtained by exploiting the binding of the substrate on the nanoparticles surface.

L’efficienza catalitica, i meccanismi e la complessità strutturale esibiti dagli enzimi sono da sempre stati un’inesauribile fonte d’ispirazione per i chimici impegnati nello sviluppo di nuovi catalizzatori[1, 2]. Gli enzimi si sono evoluti come grandi e complesse strutture di centinaia di migliaia di Dalton in cui subunità anche lontane dal sito attivo possono profondamente influire sull’attività dell’enzima medesimo[3]. La più bassa complessità strutturale dei sistemi catalitici artificiali basati sulla mimica enzimatica potrebbe essere un’importante ragione della loro efficienza tipicamente modesta. Questa consapevolezza ha diretto l’attenzione verso catalizzatori basati su scaffolds multivalenti come i dendrimeri[4], le micelle[5] e le nanoparticelle[6] con l’intento di aumentare la complessità dei suddetti sistemi sintetici. La sfida fondamentale è rappresentata dalla realizzazione semplice e diretta di catalizzatori sintetici che siano paragonabili in dimensioni e complessità agli enzimi. La necessità di sintesi laboriose può essere superata sfruttando l’auto-assemblaggio per l’ottenimento di strutture multivalenti. In particolare, l’auto-assemblaggio di monostrati catalitici sulla superficie di nanoparticelle d’oro (AuNPs) per dare clusters d’oro protetti da monostrato (Au MPCs) sta emergendo come un’efficacie strategia[7, 8]. Tuttavia, l’eccessiva omogeneità chimica della struttura derivante intrinsecamente dal processo di auto-assemblaggio dei tioli rimane un problema analogo all’eccessiva semplicità dei modelli non nano-derivati[9]. Tentativi di variegare la superficie delle nanoparticelle con tioli diversi mediante processi di clusterizzazione si sono dimostrati di difficile approccio; infatti, poiché la sintesi rimane basata sull’auto-assemblaggio, la composizione finale del sistema risulta troppo eterogenea in termini di decorazione delle superfici nanoparticellari. Ne conseguono enormi sforzi per la separazione e purificazione delle diverse specie. Per questa ragione negli ultimi anni si è fatto largo un nuovo approccio basato sulle nanoparticelle non come tools da impiegare in quanto tali, bensì come scaffolds dalla superficie omogenea ai quali far aderire molecole secondarie per ottenere sinergicamente l’effetto finale desiderato. Rotello e collaboratori sono stati tra i primi pionieri in questo ambito con lo sviluppo di innovativi biosensori basati su nanoparticelle d’oro funzionalizzate con tioli cationici[10]. Inspirandosi a questi lavori, recentemente, Prins et al. hanno sviluppato strutture etero-funzionalizzate, multivalenti basate sull’auto assemblaggio di piccoli ligandi sulla superficie di nanoparticelle d’oro[11, 12]. In questo modo è stato possibile dimostrare, con un approccio supramolecolare, come si possa finemente regolare la composizione della superficie delle nanoparticelle sfruttando le differenti affinità degli oligoanioni. Di conseguenza si è potuto superare in maniera semplice ed efficace il già citato problema dell’eccessiva omogeneità chimica legata ai sistemi supramolecolari e alle nanoparticelle d’oro funzionalizzate. Quest’idea è stata ulteriormente sviluppata durante l’internato di dottorato[13, 14]. Infatti, sfruttando la natura auto-assemblante degli oligo-anioni su sistemi nanoparticellari cationici, si è pensato di andare oltre il semplice controllo della composizione superficiale di ligandi e di realizzare un vero e proprio sistema nano-enzimatico artificiale di natura supramolecolare. Esso è composto da due elementi fondamentali: 1. Nanoparticelle d’oro passivate con tioli alchilici recanti in posizione Ω un gruppo trimetilammonico (8-Trimetilammonio ottiltiolo  NR4+-AuNPs) in modo da generare una superficie cationica; 2. Oligo-peptidi anionici in grado di legarsi alla superficie delle nanoparticelle. Questi si caratterizzano per una coda C-terminale composta di tre residui di acido aspartico, per un’estremità N-terminale composta di un numero variabile d’Istidine (H0-H3), unite da un residuo di Triptofano (Ac-HnWDDD-OH). Le quattro cariche negative dei residui di Acido aspartico garantiscono un binding efficiente alla superficie cationica, mentre i residui d’Istidina e il Triptofano permettono, rispettivamente, la catalisi e la misurabilità del peptide stesso in termini di concentrazione e binding. Ciascuno dei due elementi preso singolarmente non è un efficiente catalizzatore. Infatti, solamente quando i peptidi si assemblano sulla superficie delle nanoparticelle, il sistema che ne scaturisce è in grado di accelerare l’idrolisi di un substrato modello come il p-Nitrofenil estere della N-CBz-(D)Fenilalanina di due ordini di grandezza rispetto al background. Oltretutto, la multivalenza della superficie nanoparticellare gioca un ruolo cruciale nella modulazione dell’attività catalitica non soltanto mantenendo substrato e catalizzatore in stretto contatto, ma generando un micro-ambiente dotato di un proprio pH locale che aumenta ulteriormente l’efficienza del sistema. Data la natura supramolecolare del sistema e ricordando quanto già visto per i lavori di Prins circa la regolazione della composizione della superficie cationica di nanoparticelle con oligoanioni, il sistema creato è finemente regolabile semplicemente dosando la quantità di componenti che si auto-assemblano sulla superficie delle nanoparticelle medesime. Una volta ottenuto il sistema lead si è voluto scendere nel dettaglio per comprendere le intime peculiarità che lo caratterizzavano come importanza della natura del substrato, importanza della natura dell’emi-catalizzatore peptidico ed importanza della natura della superficie cationica. La sequenza dell’emi-catalizzatore peptidico gioca un ruolo fondamentale nell’efficienza della catalisi con dei requisiti molto stringenti per quanto riguarda l’ordine dei singoli amminoacidi. Mutazioni a carico della sequenza H1 (Ac-HWDDD-OH) concernenti l’ordine e alla lunghezza hanno permesso di concludere che il Triptofano ha un ruolo accessorio nel binding e che la sua posizione deve essere adiacente alla coda anionica C-terminale. L’Istidina deve occupare l’estrema posizione N-terminale perché la presenza di amminoacidi in detta posizione ingombrerebbe il residuo imidazolico diminuendo l’efficienza catalitica del sistema. L’allungamento della sequenza, a parità di ordine, si traduce ancora una volta in una diminuzione dell’attività in ragione di un minore effetto del pH locale, ma con ripercussioni molto inferiori rispetto all’ingombro sterico. Analogamente ad un enzima naturale, tale sistema si è dimostrato avere dei precisi requisiti anche per quanto riguarda le caratteristiche dei substrati che ad esso si vanno a legare. Studi SAR sulla natura del substrato sono stati condotti utilizzando analoghi che presentassero modifiche alla natura e dimensioni del gruppo protettore dell’α-ammina e della catena laterale. I risultati ottenuti hanno permesso di concludere che, in generale, substrati più grandi e idrofobici hanno maggiore affinità per le nanoparticelle in ragione di un probabile nascondimento di superfici idrofobiche nel core alchilico. A parità d’idrofobicità le superfici aromatiche presentano una maggiore affinità e subiscono più facilmente idrolisi (si veda il caso di N-CBz-Leu-ONP e N-CBz-(L)Trp-ONP). Il gruppo protettore dell’α-ammina sembra rivestire un ruolo cruciale nella stabilizzazione del substrato: una riduzione delle sue dimensioni, con conseguente diminuzione dell’idrofobicità, si traduce in un’elevata tendenza all’idrolisi spontanea rendendo inutile il catalizzatore. Tentativi di migliorare la catalisi con approccio supramolecolare sono stati condotti auto-assemblando il sistema in maniera mista con il peptide H2 (Ac-HHWDDD-OH) e una libreria di peptidi (Ac-XXWDDD-OH, dove XX sono Leu, Phe, Ser e Arg nelle 42 combinazioni possibili) ritenuti essere modulatori dell’attività catalitica. I risultati ottenuti non sono stati in linea con le attese e questo probabilmente in relazione al fatto che il l’annullamento dell’effetto di pH non viene compensato dalle necessarie interazioni tra il sistema ed il substrato medesimo traducendosi in una diminuzione dell’attività. Mutazioni a carico della sequenza H1 mediante inserzione di coppie d’identici amminoacidi ai lati del residuo istidinico (Ac-XHXWDDD-OH) sono state condotte nel tentativo di ottenere un intorno chirale che permettesse una catalisi enantioselettiva. Nonostante la forte eterogeneità dei residui scelti (Leu, Phe, Ser, Tyr), il sistema non ha dato i risultati attesi. Dunque, a livello catalitico non sembra essere possibile discriminare gli enantiomeri, ma è auspicabile una discriminazione al momento del binding alla superfici cationica come ci hanno suggerito alcune evidenze sperimentali.