Biochemical and functional characterization of p23, a regulatory co-chaperone of HSP90 in Arabidopsis

In the present Ph.D. thesis it is reported a molecular and functional study of the Arabidopsis p23, a key component of the HSP90 complex. Homologues of the p23 co-chaperone of HSP90 have been found in all eukaryotes, suggesting conserved functions for this protein throughout evolution. While p23 has been well studied in animals, little is known about its function in plants. Arabidopsis owns two isoforms of p23 and their expression pattern was analysed in planta. We characterized the expression profile of the two isoforms founding redundant functions in the analysed pathway. In order to determine the function of the two p23 paralogue genes, we selected knockout homozygous insertional mutant lines and overexpressing transgenic lines for both genes. The analysis of the knockout mutant and overexpressing lines showed these proteins as in involved in Nitric oxide production both in physiological processes and in stress induced conditions. All the lines showed alteration in root growth parameters, suggesting a likely involvement of p23 in auxin regulation. So to understand the molecular mechanisms underlying the growth alterations observed in p23 knockout mutants, the involvement of auxin and Nitric Oxide was investigated

In questo lavoro di tesi è stato eseguita l’ analisi della funziona della co-chaperone p23 di HSP90, analizzando diversi aspetti dell’espressione, regolazione e funzione, in modo da riuscire ad ottenere una caratterizzazione di ampio raggio della proteina. HSP90 e p23 sono proteine fortemente conservate in tutti gli eucarioti, ma gli studi sono stati condotti, finora, principalmente in ambito animale. Questo lavoro ha lo scopo di individuare il ruolo ricoperto da p23 in pianta, organismo nel quale HSP90 stessa ha dimostrato di avere un pattern funzionale solo in parte simile a quello animale, e ricco di funzioni caratteristiche per il regno vegetale. In Arabidopsis thaliana sono presenti due isoforme di p23 e la caratterizzazione della proteina è stata condotta su entrambe le isoforme parallelamente, studiando l’espressione in planta e la regolazione tramite fosforilazione. Innanzitutto è stato dimostrato che entrambe le proteine sono fosforilate specificamente dalla forma monomerica della chinasi CK2, e che le due isoforme di p23 sono fosforilate da diverse subunità catalitiche di CK2. Questo comportamento suggerisce nuove ipotesi sulla fosforilazione da parte di CK2 in pianta, in quanto finora le diverse isoforme di CK2 presenti in pianta avevano mostrato solo funzioni ridondanti. Sebbene questi studi in vitro, dovranno essere confermati dalla caratterizzazione in vivo della fosforilazione, rivelano che p23 possiede una regolazione post-trascrizionale specifica, individuano la chinasi responsabile della fosforilazione ed indentificano il residuo fosforilato di p23-1 nella Serina 222. La regolazione delle proteine è stata studiata anche tramite l’analisi dell’espressione in planta, sia analizzando i livelli dei messaggeri, sia identificando i presunti promotori delle due proteine ed ottenendo piante reporter stabilmente trasformate. Entrambe le analisi sono state effettuate a diversi stadi dello sviluppo e su diversi organi, ed hanno permesso di ottenere un quadro completo dell’espressione delle due proteine in pianta. Le due proteine sono espresse nei tessuti floematici in tutta la pianta: dal meristema radicale alle foglie, ed i due promotori hanno mostrato attività fortemente tessuto specifica. L’analisi del livello dei trascritti tramite qRT-PCR ha evidenziato che p23-1 è espressa a livelli maggiori di p23-2, e ha confermato che le due proteine hanno lo stesso pattern di espressione. I trattamenti effettuati, inoltre, non hanno indotto cambiamenti nel pattern di espressione. È stata inoltre studiata la localizzazione subcellulare delle due proteine tramite l’utilizzo di piante stabilmente trasformate esprimenti le proteine fuse ad un reporter fluorescente, sotto il controllo di un promotore costitutivo. L’analisi tramite microscopia confocale delle piante reporter ha rivelato la localizzazione citosolica e nucleare di entrambe le proteine. Lo studio funzionale di p23 è stato, inoltre, condotto tramite la generazione di diversi strumenti genetici come il doppio mutante knockout e i singoli mutanti overesprimenti. Per questo tipo di studi sono stati generati mutanti che overesprimono singolarmente le due proteine fuse al tag HA. L’analisi di questi mutanti ha portato alla scoperta di un ruolo di p23 nella crescita e nello sviluppo sia della radice primaria che delle radici secondarie, infatti il doppio mutante knockout mostra radici più corte, rispetto al wild type, mentre le linee overesprimenti mostrano radici più lunghe. Inoltre p23 sembra avere un ruolo anche nella produzione del monossido d’azoto, un importante molecola segnale nel regno vegetale. Sono stati condotti esperimenti preliminari per testare se la crescita ridotta del mutante knockout fosse dovuta alla minore produzione di NO, ma i risultati suggeriscono che il monossido di azoto sia coinvolto nella crescita delle radici ma non sia il fattore principale nel fenotipo mostrato dal mutante di p23. È stata inoltre testata la capacità del doppio mutante knockout di produrre NO sotto elicitazione con acido salicilico, ed è stato dimostrato che sia la mancanza di p23 sia la mancanza dell’isoforma HSP90.1, impediscono la corretta produzione di NO, quindi si ipotizza che il signalling del acido salicilico, un ormone vegetale coinvolto nella risposta all’attacco di patogeni, sia compromessa nel mutante doppio knockout di p23. Durante il lavoro di tesi è stato inoltre condotto un approfondimento tecnico sul comportamento di una ben nota molecola scavenger del monossido di azoto, il cPTIO, in presenza di cellule o tessuti vivi. È stato quindi dimostrato che questa molecola subisce delle reazioni che ne fanno scomparire il segnale EPR, quando incubata in presenza di materiale vivo. Questa nota tecnica risulta particolarmente utile, in quanto in base alle cinetiche di degradazione mostrate, si potrà decidere quali sono le concentrazioni più appropriate in base alla durata degli esperimenti. Il progetto ha approfondito la conoscenza della funzione di p23 sia tramite l’analisi biochimica della fosforilazione da parte di CK2 di p23, sia analizzando il comportamento dei diversi mutanti. È stato individuato un ruolo centrale per p23 nella produzione di NO e nello sviluppo della radice. In particolare viene mostrato che la crescita subnormale delle radici del mutante knockout di p23 dipende da un alterata crescita del meristema radicale. Il meristema radicale è controllato da un fine meccanismo dipendente dall’equilibrio fra citochinine ed auxina, è il progetto sta ora evolvendo verso l’analisi dell’equilibrio di questi ormoni nei diversi mutanti