Zebrafish as a model for dissecting the in vivo roles of Collagen VI

My PhD project was focused on using Danio rerio (zebrafish) as an in vivo model to dissect the expression and function of Collagen VI (COL6), a key extracellular matrix component found in several tissues and involved in a range of physiological and pathological processes. Mutations of COL6 genes in humans can cause different forms of inherited muscular diseases, including Bethlem myopathy and Ullrich congenital muscular dystrophy. A number of animal models were generated for COL6-related myopathies, displaying a spectrum of phenotypes. In particular, studies carried out in COL6 knockout (Col6a1–/–) mice provided a valuable tool for throwing light on the in vivo roles of COL6. Indeed, those studies demonstrated that COL6 exerts several cytoprotective functions, which span from counteracting apoptosis and oxidative damage, to the regulation of cell differentiation and autophagy. Despite this, no study until now ever assessed in detail which functions COL6 plays during development and in regulating intracellular signalling pathways. To gain further insights into these aspects, we decided to exploit zebrafish, a model that has been widely used for studies of vertebrate development and gene function. Indeed, thanks to its transparency and rapid development, zebrafish represents a powerful tool to visualize the expression pattern of a gene in the whole organism. In addition, the availability of transgenic biosensor lines makes zebrafish an ideal tool for the in vivo study of signaling pathways. During the first part of my PhD, I characterized in detail the spatio-temporal expression pattern and distribution of COL6 in zebrafish embryos, larvae and adults. The results I obtained demonstrate that zebrafish COL6 genes exhibit features that are very similar to those found in their mammalian orthologs. In particular, by exploiting a new antibody generated against zebrafish COL6, I was able to characterize precisely the expression pattern of this distinctive ECM protein during zebrafish development and adult life. These data are of major relevance since they provide the basis for functional studies in this animal model, and they have been collected in a manuscript entitled “Spatio-temporal expression and distribution of collagen VI during zebrafish development”, which is currently under revision. In the second part of my PhD, I carried out a number of functional studies exploiting a novel zebrafish col6a1 null line generated through CRISPR/Cas9 site-specific mutagenesis. The ablation of COL6 in this zebrafish model allowed me to identify neuromuscular defects and distinctive alterations in the three-dimensional architecture of craniofacial cartilages. In addition, knockout of COL6 affected Wnt signaling during embryogenesis, thus pointing at a potential role of COL6 in regulating this major signalling pathway. Altogether, the zebrafish col6a1 null line represents a valuable tool to unveil previously unknown links between molecular and signaling defects and COL6 deficiency. Indeed, the data reported in this thesis underline how zebrafish represents a very useful in vivo model for increasing our understanding of the role of this major ECM protein in different physiological and pathological contexts, both during development and adult life. Moreover, the zebrafish col6a1 null line represents a suitable tool for future drug testing aimed at finding novel treatments for COL6-related diseases.

ll mio progetto di dottorato si è basato sull'utilizzo del modello animale Danio rerio (zebrafish) al fine di analizzare l'espressione e la funzione del collagene VI (COL6), un componente chiave della matrice extracellulare presente in vari tessuti e coinvolto in numerosi processi fisiologici e patologici. Mutazioni a carico dei geni codificanti per le catene del COL6 sono note causare diverse forme di malattie muscolari ereditarie nell'uomo, tra cui la miopatia di Bethlem e la distrofia muscolare congenita di Ullrich. Diversi modelli animali sono stati generati al fine di studiare queste miopatie. In particolare, gli studi condotti su topi knockout per il COL6 (Col6a1–/–) hanno permesso di mettere in luce alcuni dei ruoli chiave che questa proteina esercita in vivo. Tali lavori hanno infatti dimostrato che il COL6 svolge importanti funzioni citoprotettive, che vanno dal contrastare l'apoptosi e i danni ossidativi alla regolazione del differenziamento e dell'autofagia. Ciò nonostante, nessuno studio ha finora mai indagato a fondo quali siano le funzioni del COL6 durante lo sviluppo embrionale e nella regolazione delle vie di segnalazione intracellulari. Pertanto, allo scopo di ottenere ulteriori conoscenze su questi aspetti, abbiamo deciso di utilizzare lo zebrafish, un modello ampiamente impiegato negli studi sullo sviluppo dei vertebrati e sulla funzione genica. Grazie infatti alla sua trasparenza e al suo rapido sviluppo, lo zebrafish rappresenta un ottimo modello per visualizzare il pattern di espressione di un gene nell'intero organismo. Inoltre, la disponibilità di numerose linee transgeniche reporter rende lo zebrafish uno strumento ideale per lo studio in vivo delle vie di segnalazione intracellulare. Durante la prima parte del mio lavoro di dottorato, ho analizzato in dettaglio il pattern di espressione spazio-temporale e la distribuzione delle diverse catene del COL6 in embrioni, larve e adulti di zebrafish. I dati ottenuti dimostrano che i geni COL6 presentano un pattern di espressione nello zebrafish molto simile a quella dei rispettivi ortologhi in mammifero. In particolare, sfruttando un nuovo anticorpo che riconosce in maniera specifica il COL6 di zebrafish, ho potuto caratterizzare in dettaglio la distribuzione della proteina in questo organismo, sia durante lo sviluppo embrionale che in età adulta. Tali dati sono di notevole interesse, in quanto forniscono una base essenziale per poter effettuare degli studi funzionali in questo modello animale. I risultati ottenuti sono stati quindi raccolti in un lavoro intitolato "Spatio-temporal expression and distribution of collagen VI during zebrafish development", il quale è attualmente in fase di revisione. Nella seconda parte del mio dottorato ho svolto studi funzionali sfruttando una nuova linea di zebrafish priva di COL6, generata nel laboratorio attraverso la tecnologia di mutagenesi sito-specifica CRISPR/Cas9. In tale linea ho individuato numerosi difetti neuromuscolari e peculiari alterazioni nella struttura tridimensionale delle cartilagini craniofacciali. Inoltre, ho identificato che l’assenza di COL6 causa alterazioni nella via di segnale di Wnt, suggerendo un ruolo del COL6 nel regolare questa via di segnalazione intracellulare. Complessivamente, i dati ottenuti dimostrano che la linea di zebrafish non esprimente il COL6 rappresenta un valido modello in vivo per svelare connessioni ancora poco conosciute tra carenza di COL6 e deficit molecolari e di vie di segnalazione. Le evidenze riportate in questa tesi sottolineano infatti come lo zebrafish sia estremamente utile nello studio del ruolo di questa proteina di matrice in diversi contesti fisiologici e patologici, sia durante lo sviluppo che nella vita adulta. Inoltre, il modello zebrafish COL6 knockout rappresenta lo strumento ideale per effettuare studi farmacologici volti ad identificare nuovi trattamenti per le malattie associate ad alterazioni del COL6.