Conditional inactivation of Emilin1 and Col6a1 genes

Conditional gene expression methods are important approaches for examining the function of particular genes in development and disease. In particular, a lentiviral vector system for RNAi- mediated in vivo silencing of Col6a1 and a Cre-loxP based procedure for conditional-inducible knockout (KO) of Emilin1 were used in this work. The use of lentiviral vectors can accelerate the generation of animals with substantial suppression of gene expression in an inducible way. Some authors have observed limitations of the technique due to low efficiency of transgenesis and mosaicism in transgenic mice. We have generated several transgenic mouse lines expressing siRNAs that target the α1(VI) mRNA. Characterization of the different lines and comparison of the phenotypes with that of Col6a1 knockout mice have allowed a systematic evaluation of the different factors affecting silencing of Col6a1, a gene of the extracellular matrix with a complex pattern of tissue-specific expression. The results, obtained with vectors pLVTHM and pLVPT-rtTRKRAB, point out three parameters as major determinants of the efficiency of interference: the choice of interfering sequence, the number of proviral copies integrated into the mouse genome and the site of integration of the provirus. A lentiviral vector (pLVPT-rtTRKRAB) with doxycycline inducible production of shRNA was also tested. Control of expression by the drug was stringent in many tissues; however, in some tissues turning off of shRNA synthesis was not complete. The data support the application of the lentiviral vectors used here in transgenesis (Frka, Facchinello, et al., 2009). Emilin1 is a gene coding for a protein, Emilin-1, of the elastic extracellular matrix expressed in interstitial connective tissue and in the cardiovascular system starting form early stages of embryonic development to adulthood. Emilin1 null mice display reduced diameter of blood vessels and arterial hypertension. The protein regulates the bioavailability of TGF-β, a cytokine with major effects on the cardiovascular system. Specifically, it has been shown that Emilin1 inhibits proteolysis of the proTGF-β precursor to LAP/TGF-β, a complex from which the growth factor can be subsequently released for receptor binding. In the absence of Emilin1, the amount of active TGF-β is increased, reducing the proliferation rate of smooth muscle cells and the diameter of blood vessels. To establish whether the Emilin1-/- phenotype is the result of a developmental defect or the function of the protein is required for the regulation of blood pressure and arterial structure also in the adult, a conditional gene targeting procedure was used to inactivate Emilin1 in a tissue and time-specific manner. The genetic set up of the transgenic mouse model included the use of floxed Emilin1, CreERT2 (a tamoxifen inducible Cre recombinase) tissue-specific drivers and Rosa26R-lacZ, an inducible reporter for histological visualization of gene rearrangement. A targeting vector was synthesized in which exons 1-2 of the Emilin1 gene were flanked by loxP sites (floxed allele). The correct integration of the targeting construct in embryonic stem (ES) cell clones was confirmed by Southern blot and PCR analyses. Four of the ES cell clones were subsequently injected into blastocysts resulting in chimeric mice with 10-100% chimerism. The CreERT2 gene was driven by the Emilin1 or the smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC) promoters in order to be expressed in cells active in Emilin1 synthesis or in smooth muscle cells respectively. After tamoxifen administration, activity of both promoters was evident in vascular and visceral smooth muscle cells, where SMMHC-CreERT2 induced recombination more strongly than Emilin1-CreERT2. PCR and RT-PCR analyses confirmed that the SMMHC-CreERT2 was expressed and efficiently excised the loxP flanked sequences in the Emilin1flox/wt locus sufficiently to reduce Emilin1 mRNA expression. Emilin1flox/flox mice appeared and bred normally and showed no difference in Emilin1 mRNA expression and in blood pressure levels as compared to controls, confirming that introduction of the loxP sites did not interfere with regulation of the gene. Moreover preliminary data showed that adult animals of the double transgenic lines Emilin1flox/flox and SMMHC-Cre-ERT2 treated with tamoxifen displayed increased blood pressure. This result suggests that hypertension in Emilin1flox/flox mice is not due to a developmental defect of blood vessels, but to the lack of a continuous effect of Emilin-1 on blood pressure regulation even in the adult.

Tecniche che prevedono il controllo dell’espressione genica tramite inattivazione condizionale sono di particolare utilità nello studio della funzione di geni durante lo sviluppo e nel determinare patologie. In questo lavoro sono stati utilizzati un sistema di silenziamento in vivo del gene Col6a1 mediante RNAi utlizzando vettori lentivirali e un sistema “Cre/loxP” per generare un modello murino di knockout condizionale inducibile. L’uso di vettori lentivirali può accelerare la generazione di animali transgenici con una consistente riduzione dell’espressione genica e in modo inducibile, anche se in letteratura alla tecnica sono state attribuite alcune limitazioni dovute alla bassa efficienza di transgenesi e alla presenza di mosaicismo nei topi così ottenuti. In questo lavoro abbiamo prodotto diverse linee di animali transgenici con diminuiti livelli di messaggero per il gene Col6a1 grazie alla produzione di siRNA. La caratterizzazione delle varie linee e la comparazione del fenotipo con quello dei topi knockout per lo stesso gene ha permesso l’identificazione dei diversi fattori che sono in grado di influire sul processo di silenziamento di Col6a1, un gene codificante per una proteina della matrice extracellulare con un complesso pattern di espressione tessuto specifica. I risultati ottenuti con i vettori pLVTHM e pLVPT-rtTRKRAB, hanno permesso di definire tre importanti fattori come maggiori determinanti nell’efficienza dell’interferenza: la scelta della sequenza interferente, il numero di copie provirali integrate nel genoma e il sito di integrazione degli stessi. É stato inoltre utilizzato un vettore lentivirale (pLVPT-rtTRKRAB) per la produzione inducibile di shRNA mediante somministrazione di doxyciclina. Il controllo dell’espressione dopo doxycicilina è risultato essere stringente in molti tessuti, anche se in alcuni la inattivazione della produzione di shRNA non è stata completa. I risultati ottenuti dimostrano l’applicabilità di vettori lentivirali nella generazione di animali transgenici (Frka, Facchinello, et al., 2009). Emilina1 è una proteina della matrice extracellulare presente nei tessuti connettivi interstiziali e nel sistema cardiovascolare a partire da stadi precoci di sviluppo embrionale e nell’adulto. I topi mancanti di Emilina1 sono ipertesi e mostrano un diametro ridotto dei vasi. Emilina1 svolge la sua funzione regolando la biodisponibilità di TGF-β, una citochina che svolge importanti funzioni nel sistema cardiovascolare. In particolare, è stato dimostrato che Emilina1 inibisce la proteolisi del precursore pro-TGF-β a LAP/TGF-β, un complesso dal quale il fattore di crescita attivo deve essere successivamente rilasciato per permetterne il legame con il recettore. In assenza di Emilina1, la quantità di TGF-β attivo è aumentata, riducendo la proliferazione delle cellule muscolari lisce e quindi il diametro del vaso. Per stabilire se il fenotipo dei topi Emilina1-/- è il risultato di un’alterata morfogenesi dei vasi o se la funzione della proteina è richiesta nella regolazione della pressione e nella struttura del vaso anche nell’animale adulto, è stato necessario produrre un knockout condizionale del gene di Emilin1 in modo da indurre l’assenza della proteina con un preciso controllo temporale e spaziale. Il modello murino prevede la presenza di siti loxP posti nel gene di Emilin1 in modo da produrre l’inattivazione genica, una Cre-ERT2 (cioè una Cre ricombinasi inducibile tramite tamoxifen) e il locus Rosa26R-lacZ (un gene reporter inducibile per la rilevazione istologica delle cellule nelle quali si è avuto il riarrangiamento genetico). É stato preparato un costrutto dove l’esone 1 e 2 del gene di Emilina1 sono fiancheggiati da due siti loxP. Mediante Southern Blot e PCR, è stata verificata la corretta integrazione del costrutto nelle cellule embrionali staminali di topo. 4 cloni ricombinanti omologhi così identificati sono stati trasferiti in vivo mediante microiniezione in blastocisti ottenendo topi chimerici con un grado di chimerismo compreso tra il 10 e il 100%. L’espressione del gene Cre-ERT2 è stato posto sotto il controllo delle sequenze promotoriali proprie di Emilina1 o, alternativamente, del gene per la catena pesante della miosina di muscolo liscio, in modo da essere attivamente espressa dalle cellule che producono Emilina1 o da quelle muscolari lisce rispettivamente. Dopo la somministrazione di tamoxifen, l’attività di entrambi i promotori è evidente sia nelle cellule muscolare lisce vascolari e viscerali, dove SMMHC-CreERT2 induce una ricombinazione più efficiente rispetto al costrutto Emilina1-CreERT2. Le analisi mediante PCR e RT-PCR confermano che la cre ricombinasi sotto il promotore della miosina di muscolo liscio induce efficientemente la ricombinazione dei siti loxP nel locus di Emilina1, permettendo in questo modo una riduzione consistente dei livelli di messaggero. I topi Emilina1flox/flox generati sono fertili e presentano un fenotipo normale e inoltre comparati con degli animali di controllo non mostrano differenze per quanto riguarda l’espressione del messaggero di Emilina1 e nei livelli di pressione sanguigna, confermando che l’introduzione dei siti loxP non interferisce con la regolazione dell’espressione del gene. Risultati preliminari inoltre indicano un aumento della pressione sanguigna nelle doppie linee transgeniche Emilina1flox/flox e SMMHC-Cre-ERT2 in seguito a trattamento con tamoxifen. Questo risultato suggerisce che l’ipertensione non è dovuta ad un’alterata morfogenesi dei vasi sanguigni, ma al ruolo continuativo di Emilina-1 nella regolazione della pressione sanguigna anche nell’adulto.