Applicazione della Teoria del Funzionale Densità allo sviluppo di QSAR

REACH has been established in 2007. Since then major interest lies in techniques such as in vitro and in silico testing able to reduce number, cost and impact of in vivo toxicity tests. In silico methods have been allowed by REACH to evaluate toxicity of chemicals. The so called computational toxicology offers new chance to industrial hygienists too. Among other, one of the most promising, and challenging, technique is represented by Quantitative Structure Activity Relationships (QSAR). Paradigm of QSAR is the existence of some quantitative relationship between biological activity, or toxicity, of chemicals and their molecular structure or properties. Measuring, or calculating, these molecular properties ( the molecular descriptors MD), for a set of molecules, should allow to obtain these relationships. QSAR is used to guess biological activity for all unknown molecules in the same chemical domain. Several techniques are available to develop a QSAR, there is no general agreement about which is the best. Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) established five principles of QSAR validation. In QSAR developing we may distinguish two major approaches. The former is a statistical approach, while the latter is a mechanistic approach, which puts emphasis on the Mechanism of Action (MOA) of molecules' toxicity. In this research molecules of polychlorinated dibenzofuranes (DBF), polychlorinated naphtalenes (PCN), polybrominated diphenyl ethers (PBDE), substituted benzene (NB) were chosen as a consequence of the supposed role of Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in their toxicity MOA. MDs as molecular polarizability and its anisotropy, molecular hardness and electrophilicity indexes (global and local) were calculated by Density Functional Theory and QSAR was developed by multivariate statistical analysis and partial least squares regression (PLSR) for 89 NB. Though statistical analysis (p value) support hypothesis of relationship between molecular electronic properties and toxicity, other results (R2adj ), response plot, suggest it should be nonlinear. Moreover, QSAR seems affected by lack of statistical robustness. Results strongly depends from composition of training set. Model's applicability domain was established by MOA similarity hypothesis, nevertheless a chance there is for presence of outliers and activity cliffs. Though the fifth OECD principle states that a QSAR model should be associated to "... a mechanistic interpretation, if possible", a mechanistic hypothesis is indispensable in order to establish the domain of the model while simple statistical correlation is only a hint about a QSAR's existence. As a whole it seems a better choice to state the fifth principle as ...if it is possible to associate a mechanistic interpretation QSAR's reliability will be greatly enhanced, otherwise every statistical correlation not grounded on mechanistic hypothesis have to deal with possible presence of model's outliers, activity cliffs and harder definition of model's application domain. Thesis is divided in 6 chapters. First one abut REACH and its role in QSAR. Second about endpoint and applicability domain issues. Third is a short introduction to DFT. Fourth is about MD used. Fifth contains the result of numerical experiments. Last is devoted to conclusions and references.

IL regolamento europeo REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals) è entrato in vigore nel 2007. Da allora un rinnovato interesse vi è per quelle tecniche come i test in vitro e in silico capaci di ridurre il numero, il costo, e l'impatto culturale dei test in vivo per la tossicità. I metodi in silico sono stati permessi dal REACH per valutare la tossicità dei chemicals. La così detta computational toxicology offre nuove possibilità anche agli igienisti industriali. Tra le tante tecniche una delle più promettenti, e difficili, è rappresentata dalle Quantitative Structure Activity Relationships (QSAR). Il paradigma delle QSAR è l'esistenza di una qualche relazione quantitativa tra l'attività biologica, o la tossicità di una molecola (endpoint) e la sua struttura o proprietà molecolari, dette perciò molecular descriptors MD. Calcolando o misurando gli MD per un set di molecole si può ottenere la relazione tra MD e tossicità QSAR e sulla base di questa stimare l'endpoint per molecole incognite nello stesso dominio chimico. Molte tecniche sono disponibili per lo sviluppo di QSAR ma non c'è accordo su quale sia la migliore. L'Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) ha stabilito cinque principi cui attenersi per la validazione di una QSAR, ma nessun modello. Nello sviluppo di QSAR possiamo distinguere due approcci: il primo è quello statistico, il secondo meccanicistico. In questo lavoro di tesi è stato adottato quello meccanicistico che pone enfasi sul Mechanism of Action (MOA) per la valutazione della tossicità molecolare e lo sviluppo della QSAR. In questa ricerca sono state esaminate piccole molecole organiche di provenienza industriale policlorodibenzofurani (DBF), policloronaftaleni (PCN), polibromodifenileteri (PBDE), derivati del benzene (NB), scelti sulla base del ruolo che nel loro MOA dovrebbe essere svolto da un particolare recettore Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR). MD come la polarizzabilità, l'anisotropia della polarizzabilità, gli indici di elettrofilicità globale e locale, l'hardness molecolare, sono stati calcolati per ciascuna molecola tramite Density Functional Theory DFT e messi in relazione con tecniche di analisi statistica multivariata e partial least squares regression (PLSR). I risultati ottenuti su di un set di 89 NB mostrano che nonostante l'analisi statistica, e più in particolare il p value indichino la possibilità dell'esistenza di una QSAR tra MD elettronici e tossicità altri risultati (R2adj ) e response plot, suggeriscono che questa relazione possa non essere lineare. Particolare influenza sui risultati statistici hanno la grandezza e la composizione del training set di molecole usate per svilupparela QSAR. Fra le cause della mancanza di robustezza statistica del modello vi è la possibile presenza di outliers e activity cliffs. Nonostante il quinto dei principi elencati da OECD affermi che un modello QSAR dovrebbe essere associato a "... a mechanistic interpretation, if possible", una ipotesi di MOA è necessaria per stabilire il dominio del modello poiché la sola correlazione statistica non garantisce la certezza dell'esistenza della QSAR. Nel complesso sembra più prudente rovesciare il quinto principio e dire che solo quando è possibile una ipotesi sul MOA è possibile ottenere un modello in grado spiegare la presenza di outliers e activity cliffs la cui presenza inficia irrimediabilmente l'affidabilità dei modelli QSAR. La tesi è divisa in 6 capitoli. Nel primo viene introdotto il tema del REACH, nel secondo vengono discussi i problemi relativi alla scelta dell'endpoint e del dominio di applicabilità del modello. Il terzo capitolo e dedicato a fornire cenni sulla DFT. Nel quarto vengono date informazioni sugli MD utilizzati. Il quinto presenta i risultati degli esperimenti numerici. Nel sesto si trovano conclusioni e bibliografia.