Protein Chemistry and Molecular Medicine

Proteomics involves the systematic study of proteins in order to provide a comprehensive view of the structure, function and regulation of biological systems. Advances in instrumentation and methodologies have fueled an expansion of the scope of biological studies from simple biochemical analysis of single proteins to measurements of complex protein mixtures. Proteomics is rapidly becoming an essential component of biological research. Coupled with advances in bioinformatics, this approach to comprehensively describing biological systems will undoubtedly have a major impact on our understanding of the phenotypes of both normal and diseased cells. Initially, proteomics was focused on the generation of protein maps using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Protein expression, or the quantitative measurement of the global levels of proteins, may still be done with two-dimensional gels, however, mass spectrometry has been incorporated to increase sensitivity, specificity and to provide results in a high-throughput format. Mass spectrometry applied to proteins offers many advantages: in addition to calculating the molecular weight with high accuracy, this technique allows to analyze and characterize the amino acid sequence. It can also be used in the study of post-translational modifications and to monitor the formation of complexes in solution. Finally it can be applied with different purposes such as the conformational analysis, analysis of the kinetics of refolding and studies on the catalytic activities of proteins. During my Ph.D. course my efforts have been mainly devoted on the use of this technique in combination with methods of protein chemistry such as the one- and two-dimensional electrophoresis, differents liquid chromatographies, solid phase peptide synthesis and use of proteolytic enzymes. Herein reported in my Ph.D. Thesis, the different treated subjects are divided into independent chapters each containing a single case study. Briefly in chapter 2 it has been proposed the study on protease nexin-1 (PN-1), the main inhibitor of thrombin in the brain, aimed at clarifying the role of the carbohydrate portion on the conformation, stability and function, through studies on recombinant protein produced in E.coli. In chapter 3 it has been showed the work on purification and chemical characterization, including de novo identification of amino acid sequence, of a similar inhibitor of phospholipase A2 extracted from the Python sebae serum, which demonstrated an effect cytotoxic pro-apoptotic and that could be exploited for the development of new anticancer strategies. In chapter 4 it has been reported the molecular dynamics that lead to the development of primary hyperoxaluria type I by studying the G41R mutant enzyme alanine: glyoxylate aminotransferase (AGT). In particular, were investigated the mechanisms leading to G41R be more susceptible to degradation and aggregation than wild type protein. Finally, chapter 5 deals with the effect of oxidative stress on the metabolism of von Willebrand Factor (VWF). The von Willebrand Factor is a very complex plasma glycoprotein whose dimensions help to regulate the hemostatic balance. Specifically, in the study was observed as the oxidation of a methionine residue located in the A2 domain of glycoprotein prevents proteolytic cleavage by ADAMTS-13, while not going to influence or, in some cases, promote proteolysis of VWF by proteases released from polymorphonuclear leukocytes in inflammatory conditions.

La proteomica riguarda lo studio sistematico delle proteine al fine di fornire una visione completa della funzione, della struttura e della regolazione dei sistemi biologici. I progressi avvenuti negli ultimi decenni, sia per quanto riguarda la strumentazione sia le metodologie utilizzate, hanno permesso di ampliare il campo di studi biologici passando dall’analisi di proteine purificate all’analisi di miscele complesse. La proteomica sta rapidamente diventando una componente essenziale della ricerca biologica ed associato ai progressi della bioinformatica, questo approccio alla descrizione dei sistemi biologici avrà indubbiamente un impatto notevole sulla nostra comprensione dei fenotipi sia delle cellule normali e malate. Inizialmente la proteomica era focalizzata principalmente sulla generazione di mappe proteiche bidimensionali utilizzando elettroforesi su gel di poliacrilammide. La verifica dell’espressione o la misurazione quantitativa dei livelli globali di proteine può ancora essere fatta sulla base dei gel bidimensionali, tuttavia oramai questi compiti sono affidati alla spettrometria di massa la quale può contare su di un’elevata sensibilità e specificità. La spettrometria di massa applicata alle proteine offre molti vantaggi: oltre a calcolare il peso molecolare con elevata precisione, questa tecnica permette di analizzare e caratterizzare la sequenza aminoacidica. Può anche essere utilizzata nello studio delle modificazioni post-traduzionali e per monitorare la formazione di complessi in soluzione. Infine può essere applicata con differenti scopi, quali l'analisi conformazionale, l'analisi della cinetica di ripiegamento e di studi sulle attività catalitiche delle proteine. Durante il dottorato di ricerca la mia attenzione è stata focalizzata soprattutto sull’utilizzo di tale tecnica abbinata a metodologie di chimica delle proteine quali ad esempio l’elettroforesi mono e bidimensionali, differenti cromatografie in fase liquida, la sintesi peptidica in fase solida e l’utilizzo di proteasi enzimatiche. In particolare in questa Tesi di Dottorato gli argomenti di studio sono stati trattati singolarmente, distinguendo i principali progetti in cui sono stato coinvolto in capitoli indipendenti. Brevemente, nel capitolo 2 è proposto lo studio di protease nexin-1 (PN-1), il principale inibitore della trombina a livello cerebrale, volto a chiarire la funzione della porzione glucidica sulla conformazione, stabilità e funzione della proteina mediante lo studio della proteina ricombinante prodotta in E. coli. Nel capitolo 3 è riportato il lavoro concernente la purificazione e la caratterizzazione chimica, in particolare dell’identificazione de novo della sequenza amminoacidica, di un analogo dell’inibitore della fosfolipasi A2 estratto dal siero di Python sebae, il quale ha dimostrato di possedere un effetto citotossico pro-apoptotico e che potrebbe essere sfruttato per lo sviluppo di nuove strategie antitumorali. Nel capitolo 4 l’attenzione è stata concentrata a chiarire le dinamiche molecolari che portano allo sviluppo di iperossaluria primaria di tipo I mediante lo studio del mutante G41R dell’enzima alanina:gliossilato amminotransferasi (AGT) analizzando in particolar modo i meccanismi che portano G41R ad essere maggiormente soggetto a degradazione e aggregazione rispetto alla proteina WT. Infine, il capitolo 5 tratta dell’effetto dello stress ossidativo sul metabolismo del fattore di von Willebrand (VWF). Il fattore di von Willebrand è una glicoproteina plasmatica estremamente complessa le cui dimensioni contribuiscono a regolare l’equilibrio emostatico. Nello specifico, è stato osservato come l’ossidazione di un residuo di metionina situato nel dominio A2 della glicoproteina impedisca il taglio proteolitico da parte di ADAMTS-13, mentre non vada ad influenzare o in alcuni casi addirittura favorisca la proteolisi di VWF da parte di proteasi leucocitarie liberate dai polimorfonucleati in seguito a stati infiammatori.