Studio di polimorfismi in geni coinvolti in patologie oculari angioproliferative

The ocular angioproliferative diseases are multifactorial diseases, characterized by a progressive degeneration of cells in the macular region of the retina which permit distinct and central vision. This means that people with these diseases gradually lose their "high definition" vision guaranteed by the macula. The most frequent cause of macular degeneration is the age-related macular degeneration (AMD), which usually affects people older than 50 years and is the leading cause of legal blindness in the elderly population. The macula may also be affected by pathology in diabetic retinopathy (DR); the presence of exudates and accumulation of fluid leaking from the capillaries, causing a condition called macular edema, are the most common cause of loss of visual function in diabetic patients. VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) and the receptor KDR (kinase insert domain receptor) regulate angiogenesis and therefore considered important factors involved in the pathological process that leads to the onset of ocular angioproliferative disease. In the first part, an association study between polymorphisms in the VEGF and its receptor KDR genes and onset of ocular diseases such as AMD and DR, has been performed. For this purpose we analyzed 16 polymorphisms (11 in the VEGF gene and 5 on the gene KDR) in a population of 226 patients with AMD, 177 patients with diabetic retinopathy and a control population of 240 healthy subjects. All the SNPs were analyzed by GenomeLab SNPStream DNA microarray technology (Beckman Coulter) that allows a large-scale genotyping. The results obtained in this first part showed a strong association between some polymorphisms of VEGF-A and, for the first time, KDR with susceptibility to the onset of ocular angioproliferative disease. A recent study showed that the CCR3 (CC chemokine receptor type 3) and corresponding ligands eotaxin 1,2,3 are expressed only in the endothelial cells lining the abnormal blood vessels of CNV from people with wet AMD and not in choroidal endothelium from people without AMD, or from those with dry AMD or other types of choroidal or retinal disorder. Therefore, in the second part of the study we have analyzed, for the first time, if single nucleotide polymorphisms in the genes CCR3 and eotaxin 1 (CCL11), eotaxin 2 (CCL24), eotaxin 3 (CCL26) are associated with the onset of AMD and DR. For this purpose we selected 46 polymorphisms (14 in the CCR3 gene, 8 in the gene CCL11, 4 in the CCL26 gene, 11 in the VEGF-A gene and 4 in the KDR gene) in 283 patients with AMD, 175 patients with diabetic retinopathy and control population of 262 healthy subjects. Genotyping analysis was performed using the Illumina BeadXpress, a high-throughput, dual-color laser detection system that enables scanning of a broad range of multiplexed assays developed using the VeraCode digital microbead technology. This technology was also used to confirm the association of VEGF-KDR pathway with AMD and DR extending the number of SNPs studied in these two genes. The analysis of allele and genotype frequencies of the CCR3 and eotaxins genes between groups of patients AMD and DR and the control group did not show any statistically significant difference. Instead, we again confirmed the importance of VEGF / KDR pathway, expanding the current knowledge on the role of this growth factor in pathophysiology of these diseases and demonstrating a genetic contribution in susceptibility to the onset of AMD and DR. The in-depth knowledge of these mechanisms could provide the basis to determine the risk of developing the disease and understand its entirety to allow the identification and synthesis of new drugs. In fact, carriers of risk alleles or non-risk may respond differently to therapy or may require different amounts of anti-VEGF (currently used in the treatment of these diseases) to increase its effectiveness.

Le patologie oculari angioproliferative sono malattie multifattoriali, tutte caratterizzate da una progressiva degenerazione delle cellule della regione maculare della retina, quella che permette la visione centrale e distinta. Ciò comporta che le persone affette da queste patologie perdano gradualmente la visione ad “alta definizione” garantita dalla macula. La causa più frequente di degenerazione maculare è la patologia detta degenerazione maculare legata all’età (AMD) che interessa solitamente persone al di sopra dei 50 anni ed è la principale causa di cecità legale nella popolazione anziana. La macula può essere interessata da patologia anche nell’ambito della retinopatia diabetica (DR); la presenza di essudati e l’accumulo di liquido che fuoriesce dai capillari, determinando una condizione chiamata edema maculare, costituiscono la più comune causa di perdita della funzione visiva nei pazienti diabetici. VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) ed il recettore KDR (kinase insert domain receptor) regolano l’angiogenesi e quindi sono considerati importanti fattori coinvolti nel processo patologico che porta all’insorgenza delle patologie oculari di origine angioproliverative. Nella prima parte dello studio è stato eseguito un’analisi di associazione tra polimorfismi presenti nei geni VEGF ed il suo recettore KDR e insorgenza di patologie angioproliferative come l’AMD e DR. Per questo scopo abbiamo analizzato 16 polimorfismi (11 sul gene VEGF e 5 sul gene KDR) in una popolazione di 226 pazienti affetti da AMD, una popolazione di 177 pazienti affetti da DR e una popolazione di controllo di 240 soggetti sani. L’analisi dei polimorfismi è stata effettuata mediante GenomeLab SNPstream (Beckman Coulter) che permette una genotipizzazione su larga scala. I risultati ottenuti in questa prima parte hanno evidenziato una forte associazione tra alcuni polimorfismi di VEGF-A e, per la prima volta, KDR con la suscettibilità all’insorgenza alle patologie oculari di origine neovascolare. Uno studio recente ha dimostrato che il CCR3 (C-C chemokine receptor type 3) e i corrispettivi ligandi eotassina 1,2,3 sono espressi a livello oculare solo in soggetti affetti da AMD di tipo neovascolare (AMD-CNV) e non in altri tipi di patologie oculari e in soggetti sani. Pertanto, nella seconda parte dello studio abbiamo analizzato, per la prima volta, se polimorfismi a singolo nucleotide nei geni CCR3 ed eotassina 1 (CCL11), eotassina 2 (CCL24), eotassina 3 (CCL26) sono associati all’insorgenza di AMD e DR. Per questo scopo abbiamo analizzato 46 polimorfismi (14 sul gene CCR3, 8 sul gene CCL11, 4 sul gene CCL26, 11 sul gene VEGF-A e 4 sul gene KDR) in 283 pazienti affetti da AMD, 175 pazienti affetti da DR e una popolazione di controllo di 262 soggetti sani. L’analisi dei polimorfismi è stata effettuata mediante BeadXpress di Illumina, un sistema high-throughput a scansione laser dual-color che consente di analizzare un'ampia varietà di saggi in multiplex sviluppati usando la tecnologia digitale a microbeads VeraCode. Quest’ultima tecnologia è stata inoltre utilizzata per confermare l’associazione del pathway VEGF-KDR con l’AMD e DR ampliando il numero di SNP studiati in questi due geni. L’analisi delle frequenze alleliche e genotipiche dei geni CCR3, eotassine 1,2,3 tra i gruppi dei pazienti AMD e DR ed il gruppo di controllo non ha evidenziato nessuna differenza statisticamente significativa. Questi risultati portano ad ipotizzare che il pathway CCR3/eotassina 1,2,3, svolga un ruolo secondario nei processi fisiopatologici che portano all’insorgenza delle patologie oculari angioproliferative. Abbiamo invece confermato nuovamente l’associazione del pathway VEGF/KDR allargando le attuali conoscenze sul ruolo di questo fattore di crescita nella fisiopatologia di tali patologie e dimostrando un contributo genetico nella suscettibilità all’insorgenza dell’AMD e DR. L’approfondita conoscenza di tali meccanismi potrebbe costituire la base per poter determinare il rischio di sviluppare la patologia e comprenderla nel suo insieme per permettere l’identificazione e la sintesi di farmaci innovativi. Infatti soggetti portatori di alleli di rischio o non di rischio potrebbero rispondere in maniera diversa alla terapia o potrebbero essere necessarie diverse quantità di farmaco anti-VEGF (attualmente utilizzato nella terapia di queste patologie) per aumentarne l’efficacia.