Skeletal muscle analysis by two different approaches: - an in vivo model to study the physiology of cellular prion protein - proteomics to identify biomarkers of illicit animal treatments

Data reported in the present thesis were obtained in two different projects. Accordingly, the thesis is divided into two chapters. The first chapter, which refers to papers I and II, reports a study aimed at unravelling the physiologic role of the cellular prion protein (PrPC) using an in vivo model of skeletal muscle regeneration. The second chapter refers to paper III in which the two dimensional electrophoresis (2DE) approach in combination with tandem mass spectrometry was used to identify potential biological markers of the illegal treatment of bulls with growth promoting agents (GPA). By focusing on the relationship between PrPC and skeletal muscle regeneration in a live model, in the first research line (Chapter I) we investigated if and how the protein influences the proliferation and the differentiation of muscle precursor cells. PrPC is a cell surface glycoprotein involved in the onset of rare and fatal neurodegenerative disorders, known as transmissible spongiphorm encephalopathies (TSE) or prion diseases. TSE occur when PrPC converts into a conformationally modified isoform that originates the prion, a novel infectious and neuro-pathogenic agent. Although much information is now available on the different routes of prion infection, both the mechanisms underlying prion neurotoxicity and the physiologic role of PrPC remain unclear. Nonetheless, use of different animal and cell models has suggested a number of putative functions for the protein, ranging from cell protection against oxidative and apoptotic challenge, to cell adhesion, proliferation and differentiation. Skeletal muscles express significant amounts of PrPC, and have been related to PrPC pathophysiology by several findings. Therefore, in order to clarify the physiologic role of PrPC, we employed a degeneration/regeneration protocol to the tibialis anterior muscle, which allowed us to compare the regeneration in mice expressing, or not, PrPC. The analyzed histological and biochemical parameters provided proof for the physiologic relevance of PrPC commitment in signalling events involved in muscle regeneration. Indeed, we observed that the absence of PrPC significantly delayed the regenerative process compared to WT muscles. In particular, we found that the lack of PrPC caused attenuation of the signalling pathway triggered by TNF-, which in turn decreased the activation of the p38 kinase pathway, and – consequently – later exit from the cell cycle, and differentiation, of myogenic precursor cells. Importantly, restoring PrPC expression completely rescued the PrP-KO muscle phenotype, highlighting that regulation of signalling pathways by PrPC has clear physiologic importance in an extraneural tissue. The second research line, described in Chapter II, was aimed at setting up a proteomic-based strategy to identify illicit drug treatments in bulls. Classical assays for detecting this kind of illegal practice are not suited to detect compounds either of unknown chemical structure, or present at levels below the quantification threshold of the presently used analytical techniques. The successful application of histological analyses of target organs, which are indirectly modified following these treatments, has suggested that approaches based on the biological effects of the molecules under consideration, rather than the direct detection of their residues, could be potentially valuable in the field. The most relevant advantage of this methodology is that cellular or tissue modifications by drugs remain evident long time after the end of illicit treatments, when chemical residues are no longer, or hardly detectable. On the other hand, this approach is significantly limited by subjective experience and evaluation skill of technicians. Thus new strategies are needed for detecting indirect biomarkers in animal fluids or tissues. These biomarkers can be naturally occurring molecules, such as proteins that are modified in structure, or in concentration, following variations of the normal condition of the animal. To identify possible biologic markers of illicit drug treatments of beef cattle, we adopted a proteomic approach, including 2D differential in gel electrophoresis (DIGE) and mass spectrometry analysis, to compare the protein expression pattern of muscle specimen from experimentally treated bulls and control animals. To this aim, bulls belonging to the treated cohort were subjected to three different pharmacological protocols, including use of growth promoting agents (GPA). Two of these treatments showed a remarkable anabolic effect compared to untreated animals, resulting in an altered skeletal muscle proteome. 2DE protein maps from treatment and control groups were compared using the DeCyder software for 2D-DIGE maps analysis. We then set out to identify, using a MALDI-tandem mass spectrometry (MS/MS) approach, all proteins showing a significant alteration in their expression levels following administration of GPA. Among differentially expressed 169 proteins, 29 were identified, most of which were found to be involved in muscle contraction and energy metabolism. These results corroborate previous findings on the mechanism of action of GPA, and may be useful to design new strategies for the discovery of illicit pharmacological treatments in bulls.

I dati riportati nella presente tesi sono stati ottenuti in due diversi progetti. Pertanto, la tesi è divisa in due distinti capitoli. Il primo capitolo, che si riferisce agli articoli I e II, riporta uno studio volto a chiarire il ruolo fisiologico della proteina prionica cellulare (PrPC) utilizzando un modello in vivo di rigenerazione del muscolo scheletrico. Il secondo capitolo si riferisce all'articolo III, in cui si è cercato di individuare possibili marcatori biologici di trattamento illecito di vitelloni con agenti promotori della crescita (GPA), utilizzando un approccio di elettroforesi bidimensionale (2DE), in combinazione con spettrometria di massa. Focalizzando l'attenzione sul rapporto tra PrPC e la rigenerazione del muscolo scheletrico in un modello in vivo, nella prima linea di ricerca (Capitolo I) abbiamo indagato se e come la proteina influenza la proliferazione e la differenziazione delle cellule precursori del muscolo. PrPC è una glicoproteina ancorata alla membrana esterna delle cellule coinvolta nella comparsa di malattie neurodegenerative rare e mortali, conosciute con il nome di encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST) o malattie da prioni. L'evento alla base delle EST è la conversione della PrPC in una isoforma con una modificata conformazione che dà origine al prione, un agente infettivo neurotossico. Anche se ora sono disponibili molte informazioni sulle diverse vie di infezione da parte del prione, sia i meccanismi alla base della neurotossicità, sia il ruolo fisiologico della PrPC rimangono poco chiari. Tuttavia, l'uso di diversi modelli animali e cellulari ha suggerito molteplici funzioni putative per la PrPC, che vanno dalla protezione cellulare contro lo stress ossidativo e stimoli apoptotici, all'adesione, proliferazione e differenziazione cellulare. Il muscolo scheletrico esprime quantità significative di PrPC, e molti studi l'hanno correlato alla fisiopatologia della proteina. Pertanto, al fine di chiarire il ruolo fisiologico della PrPC in questo tessuto, abbiamo impiegato una protocollo di degenerazione/rigenerazione del muscolo tibiale anteriore, che ci ha permesso di confrontare il processo rigenerativo in topi che esprimono, o meno, PrPC. I parametri istologici e biochimici analizzati hanno fornito prove della rilevanza fisiologica della PrPC e del suo coinvolgimento negli eventi di segnalazione coinvolti nella rigenerazione muscolare. Infatti, è stato osservato che l'assenza della PrPC ritarda significativamente il processo di rigenerazione rispetto ai muscoli WT. In particolare, abbiamo trovato che la mancanza di PrPC causa un'attenuazione della via di segnalazione attivata dal TNF-alpha, che porta ad una ridotta attivazione della chinasi p38, e - conseguentemente - ritarda l'uscita dal ciclo cellulare e la differenziazione dei precursori miogenici. È importante sottolineare che il ripristino dell'espressione della PrPC abolisce completamente il fenotipo osservato nei muscoli di topi PrP-KO, sottolineando che la regolazione delle vie di segnalazione da parte PrPC ha una chiara importanza fisiologica anche in tessuti extraneuronali. La seconda linea di ricerca, descritta nel capitolo II, è stata volta a creare una strategia basata su tecniche di proteomica per l'identificazione di trattamenti farmacologici illeciti in vitelloni. L'approccio classico per la rilevazione di questa pratica illegale non è adatto ad individuare composti sia di struttura chimica sconosciuta, sia di farmaci presenti a livelli inferiori alla soglia di quantificazione delle tecniche analitiche attualmente impiegate. Il successo delle analisi istologiche di organi bersaglio, che vengono indirettamente modificati a seguito di questi trattamenti, ha suggerito che gli approcci basati sulla ricerca degli effetti biologici delle molecole in esame, piuttosto che sulla rilevazione diretta dei loro residui, potrebbero essere molto utili. Il vantaggio più rilevante di questa metodologia è che le modificazioni del tessuto indotte da un trattamento farmacologico rimangono evidenti molto tempo dopo la fine dei trattamenti illeciti, quando i residui chimici non sono più, o quasi, rilevabili. D'altra parte, questo approccio è notevolmente limitato dalla capacità di valutazione dei tecnici e l'analisi e influenzata dalla soggettività. Per questo, sono necessarie nuove strategie per il rilevamento dei biomarcatori indiretti presenti nei fluidi animali o nei tessuti. Questi biomarcatori possono essere molecole naturalmente presenti, come ad esempio proteine che abbiano subito modifiche nella struttura, o nella concentrazione, a seguito di variazioni della condizione fisiologica dell'animale. Per identificare tali marcatori biologici di trattamenti farmacologici illeciti nei bovini da carne, abbiamo adottato un approccio proteomico, mediante elettroforesi differenziale su gel in due dimensioni (2D-DIGE) e analisi in spettrometria di massa, al fine di confrontare i pattern di espressione proteica di muscolo scheletrico tra animali trattati farmacologicamente e di controllo. A questo scopo, i vitelloni appartenenti al gruppo di trattamento sono stati sottoposti a tre differenti protocolli farmacologici, mediante l'impiego di agenti promotori della crescita. Due di questi trattamenti hanno portato ad un notevole effetto anabolico rispetto agli animali non trattati, mostrando di conseguenza un'alterazione del proteoma del muscolo scheletrico. Le mappe proteiche dei campioni appartenenti ai gruppi di trattamento e di controllo sono state confrontate utilizzando il software DeCyder per analisi di dati derivanti da 2D-DIGE. Si è poi cercato di identificare, con un approccio di spettrometria di massa (MALDI) in tandem (MS/MS), tutte le proteine che mostrano una significativa alterazione nei loro livelli di espressione in seguito a somministrazione di agenti promotori della crescita. Tra le 169 proteine che cambiano in espressione in seguito al trattamento farmacologico, sono state identificate 29 proteine diverse, la maggior parte delle quali è coinvolta nella contrazione muscolare e nel metabolismo energetico. Questi risultati confermano i precedenti risultati sul meccanismo d'azione degli agenti promotori della crescita, e possono essere utili per sviluppare nuove strategie per l'identificazione di trattamenti farmacologici illeciti nei bovini da carne.