Il topo knock out per calsequestrina 1 (CASQ1): adattamento morfologici e funzionali dei muscoli fast twitch e reversione del fenotipo mediante elettroporazione in vivo

The amplitude of calcium (Ca2+) transients and the ultrastructure of the Ca2+ release units (CRU) are significantly altered in EDL skeletal fibers of mice lacking Calsequestrin 1 (CASQ1-null), as shown in Paolini et al., 2007. Whether these alterations are all directly related to CASQ1 removal or in part due to compensatory mechanisms remain to be determined. The aim of this study is to assess whether the re-introduction of CASQ1 is sufficient to completely rescue the phenotype. CASQ1-null FDB (flexor digitorum brevis) muscle is preliminary characterized in terms of SR protein composition, morphology, and Calcium transients. In fibers from FDB, CASQ1 ablation is accompanied by a decreased expression of CASQ2, Triadin 95, Sarcalumenin, and Serca 1. Ultrastructural alterations of CRUs include flat cisternae, abnormal proliferation of Sarcoplasmin Reticulum (SR), longitudinal orientation of triads, and doubled RyRs channels. Impairment of calcium storage and release is detected both at low and high frequency stimulation: the peak amplitude at 0,5 Hz is significantly decreased and at 60 Hz the CASQ1-null FDB fibers are unable to sustain prolonged Calcium release. To rescue the CASQ1-null phenotype, exogenous mouse CASQ1 was expressed in adult CASQ1-null FDB muscles by in vivo DNA electrotransfer. Electron microscopy shows that the size of the jSR lumen is significantly increased and that the terminal cisternae are indeed filled with electron-dense material, i.e. CASQ1. Even if the expression of CASQ2, Sarcalumenin, Triadin, Sarcalumenin, and Serca1 did not change upon CASQ1 re-expression, the peak amplitude of Ca2+ transients induced by electrical stimulation in CASQ1-transfected fibres at 0,5 Hz frequency stimulation is significantly increased when compared to controls. In addition, during prolonged tetanic stimulation at 60 Hz, cytosolic Ca2+ level is maintained, thus indicating that upon CASQ1 expression the ability of the SR to store and release Ca2+ is fully recovered. These results provide evidence that CASQ1 directly controls size of terminal cisternae, and modulates the Ca2+ dynamics in skeletal fibers. The second part of this work deals with atrophy pathways in EDL CASQ1-null during development, adulthood, and senescence. CASQ1 trend in WT, as well as CASQ2 trend in WT and in CASQ1-null during development are preliminary described: a more dramatic and accelerated decrease of cardiac isoform is noticed in knock out muscles. Decrease of CSA (cross sectional area) of CASQ1-null fibers is already found at 11 post natal days and SR stress (as upregulation of BiP, Calreticulin, and GRP94 expression) is detected at 1 month. EDL CASQ1-null adult muscle shows (i) a decrease of CSA of about 20%, (ii) activation of ubiquitin Proteasome system (analysed with western blots of total ubiquitinylated proteins, Atrogin, and MuRF1), (iii) upregulation of autophagic potential (as deduced from increase in LC3 I e II forms), and (iv) upregulation of procaspase 3, 9, and 12: hence the SR stress state is still present. At 4 month, the upregulation of mitochondria number and volume is sustained by upregulation of PGC1-α expression and active mitochondriogenesis. In CASQ1-null EDL from aged muscles (25 month old) are described: saturation of proteolytic system of ubiquitin Proteasome (detected as down regulation of markers) and of autophagic pathway (as abnormal autophagosome). At 30 month appearance of cores composed by degeneration of sarcoplasmic reticulum, T Tubuls, and contractil proteins is observed. The decrease of PGC1-α and the inhibition of mitochondriogenesis are confirmed by damage and absence of mitochondria. Mitochondria proliferation in the adult could worsen the condition of the aged muscle due to excessive production of ROS. The progressive damage of CASQ1-null Fast twitch muscle could be due to perturbation of Calcium signaling that leads to compromised development, progressive saturation of proteolytic systems, and appereance of core-like myopaty.

L’ampiezza dei transienti di Calcio e l’ultrastruttura delle unità di rilascio di Calcio (CRUs) sono significativamente alterate nelle fibre di muscolo EDL come già illustrato in Paolini et al., 2007. Rimane ancora da determinare se queste alterazioni siano direttamente conseguenti all’ablazione della CASQ1 o siano in parte dovute ad altri adattamenti compensatori. Lo scopo della mia tesi di Dottorato è verificare se la reintroduzione della CASQ1 in un muscolo FDB (flexor digitorum brevis) CASQ1-null sia in grado di revertire il fenotipo null. Il muscolo FDB CASQ1-null è stato preliminarmente caratterizzato confrontato al WT (wild type) sia dal punto di vista di composizione delle principali proteine dell’SR, sia dal punto di vista morfologico e del rilascio di Calcio. Nel muscolo FDB l’assenza della CASQ1 è associata a diminuzione significativa di CASQ2, Triadina 95, Sarcalumenina e Serca 1. Le alterazioni strutturali comprendono cisterne appiattite e svuotate di contenuto, anomala proliferazione del Reticolo giunzionale, orientamento longitudinale delle triadi e raddoppio dei canali RyRs. Difetti a carico del rilascio di Calcio dall’SR si osservano nel CASQ1-null sia nelle stimolazione a bassa che alta frequenza: l’altezza del picco di Calcio diminuisce significativamente a 0,5 Hz e le fibre non riescono a sostenere il rilascio prolungato a 60 Hz. Per revertire il fenotipo CASQ1-null si è reintrodotta nell’FDB CASQ1-null la CASQ1 veicolata da un vettore plasmidico, mediante elettroporazione in vivo. La microscopia elettronica (ME) dimostra che il volume delle cisterne terminali viene ripristinato e il Reticolo giunzionale risulta riempito di materiale elettrondenso, tipico aspetto della CASQ1 in ME. Anche se non si osservano variazioni nell’espressione proteica di CASQ2, Triadina 95, Sarcalumenina e Serca1 i transienti di Calcio a 0,5 Hz aumentano rispetto ai controlli trasfettati con vettore senza CASQ1. Inoltre il livello di Calcio citosolico rilasciato viene mantenuto durante la stimolazione ad alta frequenza dopo l’espressione della CASQ1, e l’SR riacquista le capacità di store e di rilascio del WT. Questi risultati dimostrano che la CASQ1 è direttamente implicata nel controllo del volume della cisterna e modula il rilascio di Calcio dall’SR. La seconda parte riguarda invece lo studio dei pathway proteolitici nel muscolo EDL CASQ1-null durante lo sviluppo, l’età adulta e la senescenza. Durante lo sviluppo si è preliminarmente descritto l’andamento di CASQ1 nel muscolo WT e di CASQ2 nel WT e CASQ1-null da 2 giorni a due mesi, osservando una diminuzione maggiore e temporalmente accelerata dell’isoforma cardiaca nel CASQ1-null. Si è descritta la precoce manifestazione dell’atrofia delle fibre CASQ1-null, già a partire da 11 giorni, e l’insorgenza dello stato di stress del Reticolo da 1 mese dopo la nascita, valutato come aumento dei chaperoni BiP, Calreticulina e GRP94. Il muscolo EDL CASQ1-null adulto presenta diminuzione del 20% a carico dell’area di tutti i tipi di fibra e l’attivazione del sistema ubiquitina Proteasoma (caratterizzato mediante western blots delle proteine ubiquitinate, Atrogin e MuRF1), aumentato potenziale autofagico (valutato mediante l’aumento di LC3 I e II) e upregolazione delle procaspasi 3, 9 e 12: risulta inoltre manifesto lo stato di stress del Reticolo. A 4 mesi il raddoppio del numero di mitocondri e del loro volume, valutati mediante ME, si associa ad elevata mitocondriogenesi descritta dall’aumento di PGC1-α. Nel muscolo EDL CASQ1-null anziano si assiste intorno ai 25 mesi a saturazione dei sistemi proteolitici dell’ubiquitina Proteasoma (con diminuzione dei markers caratteristici) ed autofagico (con presenza di autofagosomi anomali), e a comparsa, a 30 mesi, di cores composti da Reticolo, Tubuli T, e proteine contrattili degenerate. La diminuzione significativa di PGC1-α e quindi il blocco della mitocondriogenesi nel CASQ1-null è confermato dell’assenza dei mitocondri in alcune zone e dal loro aspetto danneggiato: la proliferazione mitocondriale potrebbe essere l’adattamento che a lungo termine determina, mediante l’aumento nella produzione di ROS, l’aggravarsi del danno nell’anziano. Il progressivo danneggiamento dei muscoli di tipo Fast twitch privi di CASQ1-null dipende con ogni probabilità alla sua origine dal disturbo dei segnali di Calcio che causa uno sviluppo compromesso, progressiva saturazione dei sistemi catabolici e insorgenza di miopatia core-like.