Designing adenosine receptors antagonists using an in silico approach

The neuromodulator adenosine affects a wide variety of physiopathological processes through activation of four receptors, classified as A1, A2A, A2B, and A3 subtypes. Adenosine receptors (ARs) belong to family A of G protein-coupled receptors (GPCRs) and are ubiquitously expressed in the human body. Activation or blockade of ARs is responsible for a wide range of effects in numerous organ systems; and therefore the regulation of ARs can have many potential therapeutic applications. The main objective of this project has been the investigation of the in silico molecular pharmacology of adenosine receptors and, in particular, of the human A2A and A3 adenosine receptors to guide the discovery and the structural refinement of new potent and selective AR antagonists. The recently published crystal structures of the human A2A adenosine receptor (hA2AAR) provide detailed three-dimensional information useful to support homology modeling studies and receptor-based drug design approaches. In particular, the 2.6 Å crystallographic structure of the hA2AAR in complex with the potent and selective antagonist ZM241385 was used as template to build a homology model of the hA3AR. In order to validate the molecular docking protocols for the adenosine receptors family, the hA2AAR crystal structure was used to perform in parallel molecular docking studies using different docking software. Then RMSD values between predicted and crystallographic poses of ZM241385 were calculated to select the docking protocol able to better reproduce this molecular system and to be used in the following molecular docking studies. Subsequently, molecular docking studies of different ARs antagonists were performed at the hA3AR model and at the hA2AAR crystal structure, enabling the exploration of the potential effects of chemical modifications of these compounds, and thus facilitating the lead optimization process. Different series of new compounds belonging to known adenosine antagonists classes, including triazolo-triazines and pyrazolo-triazolo-pyrimidines, have been analyzed and modified with the aim to modulate their affinity towards different adenosine receptor subtypes, to increase their solubility, or to overcome their metabolic instability. Moreover, several compounds with simplified scaffolds have been proposed as new adenosine receptor antagonists; such as pyrazolo-pyrimidinones, phthalazinones and triazolo-pyrimidines. Finally, the knowledge gained through the docking studies led to the identification of structural features of antagonist compounds important for the interaction with the hA3AR and was applied to the design of fluorescent ligands for this subtype, of particular interest as pharmacological probes. In conclusion, the integration of in silico studies with synthetic work and pharmacological tests resulted to be a good strategy for the development of new compounds as adenosine receptors antagonists and led to a better understanding at the molecular level of this class of GPCRs.

L’adenosina è un neuromodulatore che regola molti processi fisiopatologici attraverso l’attivazione di quattro diversi recettori accoppiati a proteine G (GPCRs), classificati come sottotipi A1, A2A, A2B e A3. I recettori adenosinici sono ubiquitari nell’organismo umano e la loro attivazione è responsabile di numerosi effetti in diversi organi. Proprio per questo motivo la regolazione dell’attività di questi recettori può avere interessanti applicazioni terapeutiche. Il principale obiettivo di questo progetto è stato l’analisi in silico a livello molecolare dei recettori adenosinici, ed in particolare dei recettori adenosinici umani A2A e A3, per guidare la scoperta e l’ottimizzazione strutturale di nuovi antagonisti adenosinici potenti e selettivi. Le strutture cristallografiche del recettore adenosinico umano A2A, recentemente pubblicate, forniscono dettagliate informazioni strutturali utili per supportare studi di homology modeling e approcci di drug design di tipo structure-based. In particolare, la struttura cristallografica del recettore adenosinico umano A2A, in complesso con l’antagonista potente e selettivo ZM241385, è stata utilizzata come templato per la costruzione di un modello per omologia del recettore adenosinico umano A3. Inoltre, con l’intento di selezionare il protocollo di docking molecolare più adatto per la famiglia dei recettori adenosinici, la struttura cristallografica del recettore adenosinico A2A è stata utilizzata per effettuare simulazioni di docking con diversi softwares in parallelo. Successivamente, le conformazioni ottenute dal docking sono state confrontate con la pose cristallografica di ZM241385 per selezionare il protocollo di docking che fosse in grado di riprodurre al meglio questo sistema molecolare e che potesse quindi essere usato per i successivi studi di docking. Sono stati quindi effettuati studi di docking molecolare di vari antagonisti adenosinici sul modello del recettore A3 e sulla struttura cristallografica del recettore A2A, in modo da ricavare informazioni che potessero facilitare il processo di ottimizzazione dei composti. Sono stati infatti analizzati numerosi nuovi composti appartenenti a classi note di antagonisti adenosinici, tra cui composti triazolotriazinici e tirazolotriazolopirimidinici, in modo da suggerire modifiche strutturali in grado di modularne l’affinità nei confronti dei vari sottotipi recettoriali adenosinici, di aumentarne la solubilità o di superarne i punti di instabilità metabolica. Diversi derivati con strutture semplificate, come per esempio composti pirazolopirimidinonici, ftalazinonici e triazolotriazinici, sono stati inoltre proposti come nuovi composti con attività antagonista nei confronti dei recettori adenosinici. Le informazioni ricavate grazie agli studi di docking hanno permesso l’identificazione di caratteristiche strutturali degli antagonisti adenosinici fondamentali per l’interazione con questi recettori. Queste informazioni sono state quindi applicate alla progettazione di derivati fluorescenti per il recettore adenosinico A3, che risultano particolarmente interessanti per il loro potenziale utilizzo in saggi farmacologici. In conclusione, quindi, questo studio sui recettori adenosinici dimostra come l’integrazione di metodologie computazionali con il lavoro sintetico e farmacologico risulta essere una strategia efficace per lo sviluppo di nuovi ligandi dei recettori adenosinici, a potenziale interesse terapeutico, e per il chiarimento di importanti aspetti strutturali riguardanti questa famiglia recettoriale e più in generale tutti i GPCRs.