New Insights In Experimental Esophageal Carcinogenesis

Gastro-esophageal reflux disease (GERD) is a relevant health problem worldwide. It impairs patients' quality of life and predisposes to intestinal-like esophageal metaplasia (i.e. Barrett's esophagus, BE), that is recognized as the major risk factor for the development of esophageal adenocarcinoma (Eac). The incidence of Eac has dramatically increased since the mid of the 1970s in the USA and Western countries for unknown reasons, while the prognosis of Eac has only slightly been improved. During the same time potent acid suppressors have been introduced for the treatment of GERD. Nowadays these drugs lead the list of the world best seller drugs with a US$ 8 billion market per year. Some authors have linked the increase of the incidence of Eac with the wide diffusion of acid suppression in the general population and among patients with GERD(1). The risk of Eac in patients with GERD is too low to justify endoscopic surveillance. On the other hand endoscopic surveillance for patients with BE is generally accepted. Clinical evidence is still lacking on the best treatment for BE, in order to minimize the risk for neoplastic progression(2). Pharmacological, surgical and endoscopic therapies have been used, without a clear evidence about the benefit of a treatment on the others (chapter 1). The experimental surgical models of reflux-induced esophageal carcinogenesis can reproduce in laboratory animals the stepwise progression from inflammation to Eac, through BE(3,4). In Chapter 2 we provide a detailed description of the microsurgical technique we used for the reflux induced esophageal carcinogenesis model, in order to increase its reproducibility and minimize the number of animals needed to set up the experiments. Chapter 3 shows the results of a study about the effect of chronic GERD on animal welfare. The main short and long-term clinical complications are analyzed, as well as the significance and prognostic value of two different scoring systems based on clinical parameters. Using these methods, humane endpoints can be defined. A time-course experiment of long-lasting GERD in the rat is presented in chapter 4 with both the histological findings and Cdx2 immunostaining(5). Two types of metaplastic lesions are described: intestinal metaplasia (BE) and multi-layered epithelium (MLE). MLE consists of four to seven layers of cells that appear as basaloid squamous cells in the basal part and columnar cells in the superficial layer. Therefore MLE is a hybrid epithelium in which both squamous and columnar epithelia coexist and is considered a "protometaplasia" (i.e. a precursor of BE). Consistently with its phenotype, MLE expresses markers of both squamous and columnar differentiation6. The presence of MLE has been associated with reflux(1). Cdx2 is a transcription factor that regulates the expression of differentiation-related molecules and it is specifically involved in intestinal cells commitment. The prevalence of Cdx2 expression (i.e. the prevalence of BE and MLE) increases significantly with time in the study, suggesting a time-dependent relationship between the "chemical" injury and the severity of the lesions. De novo Cdx2 expression is shown to be an early event among the morphological changes caused by the refluxate, consistently with the results by Pera and collaborators(7), who described Cdx2 immunostaining in the basal cell layer close to esophageal ulcers 16 weeks after surgery. Chapter 5 provides evidence of both esophagitis cystica profunda, metaplasia and Eac in the model in use. Esophagitis cystica profunda has been defined as a highly differentiated mucinous lesion commonly found in the submucosa at the site of surgical anastomosis(8). This entity has to be considered an inflammatory reaction, caused by the surgical insult. On the other side we present an external validation that both intestinal metaplasia (i.e. BE) and true Eac can be obtained using our surgically-induced reflux model. Chapter 6 is an experimental study on the effect of long-term proton pump inhibitor (PPI) treatment in the rat model of reflux-induced esophageal carcinogenesis. Consistently with the literature, describing PPIs as very effective drugs in ulcer healing, ulcers resulted more severe in the placebo group, compared with the PPI group, in our study. Surprisingly, esophagitis cystica profunda was more common among PPI-treated animals. This mucous-producing lesion has been generally described as well differentiated mucinous adenocarcinoma. However, we consider these tumours as inflammatory reactions, consistently with Ten Kate and collaborators(8). Of note, the misinterpretation of those lesions as adenocarcinomas could lead to the false belief that PPI treatment had increased the incidence of adenocarcinoma in the present study. On the contrary, an effect of the drug on the incidence of carcinomas was not demonstrated by our study. Surgical anti-reflux treatments and acid-suppressors in humans aim primarily to relieve symptoms of GERD. Anti-reflux surgery offers the advantage of reducing both acid and bile reflux, which has been shown to act synergistically in the pathogenesis of Barrett’s esophagus(9). On the other hand, PPIs are acid suppressors. The effect of PPIs in preventing or inducing Eac progression in patients with GERD or BE is controversial. In vivo experimental studies of reflux treated with proton pump inhibitor have not revealed a reduction in adenocarcinoma risk(10-12). However using the esophagoduodenostomy model for esophageal reflux in the rat a recent study comparing refluxates of different pH found that non-acidic refluxate increases the occurrence of intestinal metaplasia with dysplasia and EAC while the low-pH gastric juice exerts a protective effect in the presence of duodenal juice(13). Acid has been recently shown to have antiproliferative effects in nonneoplastic Barrett's epithelial cells cultured in vitro and it has been suggested that the prescription of acid suppressors in dosages beyond those required to control GERD symptoms could be detrimental(14). Gastric acid secretion is a complex, tightly regulated, physiological mechanism, with neural, hormonal, paracrine, and intracellular pathways. Gastrin, histamine, acetylcholine are the major stimuli for acid secretion, that is primarily inhibited by somatostatin, and to a lesser extent by cholecystokinin, atrial natriuretic peptide, and nitric oxide(15). PPIs act on the final common pathway of gastric acid secretion, permanently inactivating the H+/K+ ATPase (proton pump) in the parietal cell. The consequent increase in gastric pH removes the negative feedback for gastrin production by G cells. As a consequence, hypergastrinemia develops in patients with GERD treated with PPIs chronically or life-long. Concerns have been expressed about the potential role of gastrin on esophageal carcinogenesis. In vitro studies suggested that BE is sensitive to the proliferative effects of gastrin via its cholecystokinin-type 2/gastrin receptor (CCK-2R)(16). An antiapoptotic role for gastrin through up-regulation of PKB/Akt in BE samples has been recently suggested and the treatment with a CCK-2R antagonist has been shown to reduce the levels of activated PKB/Akt(17). A better understanding of the effect of pathways regulating gastric secretions could lead to new pharmacological strategies to treat gastroesophageal reflux disease.

La malattia da reflusso gastroesofageo (MRGE) è un problema clinico di rilevanza mondiale. Influisce negativamente sulla qualità di vita dei pazienti e predispone alla metaplasia esofagea di tipo intestinale (Esofago di Barrett, EB), che è riconosciuta essere il principale fattore di rischio per lo sviluppo di adenocarcinoma esofageo (ACE). L'incidenza di ACE è aumentata drasticamente negli USA e paesi occidentali dalla metà degli anni Settanta per ragioni sconosciute, mentre la prognosi di ACE rimane infausta. Nello stesso periodo sono stati introdotti efficaci soppressori acidi per il trattamento della MRGE. Allo stato attuale queste terapie guidano la classifica dei farmaci più venduti al mondo con un mercato annuo di 8 miliardi di dollari. Alcuni Autori hanno collegato l'aumento nell'incidenza di ACE con l'ampia diffusione di soppressori acidi nella popolazione generale e tra i pazienti con MRGE(1). Il rischio di ACE nei pazienti con MRGE è troppo basso per giustificare una sorveglianza endoscopica. D'altro canto il follow up endoscopico per i pazienti con EB è generalmente accettato. Tuttora manca evidenza clinica sul miglior trattamento per BE al fine di rendere minimo il rischio di progressione neoplastica(2). Le varie terapie in uso, farmacologiche, chirurgiche ed endoscopiche, non hanno ancora dimostrato una chiara evidenza di beneficio di un trattamento sugli altri (capitolo 1). I modelli chirurgici sperimentali di carcinogenesi esofagea indotta da reflusso possono riprodurre negli animali da laboratorio la progressione a tappe dall'infiammazione all'ACE, attraverso il BE(3,4). Nel capitolo 2 viene fornita una descrizione dettagliata della tecnica microchirurgica in uso per il modello di carcinogenesi esofagea indotta da reflusso, al fine di aumentare la riproducibilità dei dati e minimizzare il numero di animali necessari per il set up sperimentale. Il capitolo 3 riporta i risultati di uno studio sugli effetti della MRGE cronica sul benessere animale. Le principali complicanze a breve e lungo termine vengono analizzate, così come l'importanza e il valore prognostico di due sistemi di valutazione del benessere basati su parametri clinici. Un esperimento time-course di MRGE cronica nel ratto viene presentato nel capitolo 4 con i risultati istologici e immunoistochimici per Cdx2(5)). Vengono descritti 2 tipi di lesioni metaplastiche: la metaplasia intestinale (EB) e il multi-layered epithelium (MLE). MLE consiste di diversi strati di cellule, da 4 a 7, che appaiono squamose basaloidi nella parte basale e colonnari nello strato superficiale. Per questo MLE è un epitelio ibrido nel quale sia l'epitelio squamoso che il colonnare coesistono e viene considerato un precursore di EB. Coerentemente con il proprio fenotipo, MLE esprime marcatori sia di differenziazione squamosa che colonnare(6). La presenza di MLE è stata associata a reflusso(1). Cdx2 è un fattore di trascrizione che regola l'espressione di molecole collegate alla differenziazione ed è coinvolto specificamente nel commitment delle cellule intestinali. La prevalenza dell'espressione di Cdx2 (vale a dire di EB e MLE) aumenta significativamente con il tempo, ad indicare una relazione tempo-dipendente tra l'insulto “chimico” e la gravità delle lesioni. L'espressione di Cdx2 de novo risulta essere un evento precoce nelle modifiche morfologiche secondarie a reflusso, in accordo con i risultati del gruppo di Pera(7), che descrive positività per Cdx2 nello strato di cellule basali in vicinanza di ulcere esofagee già dalla sedicesima settimana dopo l'intervento. Il capitolo 5 dimostra la presenza sia di esophagitis cystica profunda, che di metaplasia e ACE nel modello in uso. L'esophagitis cystica profunda è stata definita come una lesione mucinosa altamente differenziata di comune riscontro a livello dell'anastomosi chirurgica(8). Questa lesione deve essere considerata di natura infiammatoria, secondaria all'atto chirurgico. Il capitolo fornisce un autorevole parere esterno che sia la metaplasia intestinale (EB) che veri ACE possono essere ottenuti utilizzando il nostro modello di reflusso indotto chirurgicamente. Il capitolo 6 è uno studio sperimentale sugli effetti del trattamento con inibitore di pompa protonica (PPI) nel modello sperimentale di carcinogenesi esofagea. Coerentemente con i dati di letteratura, che riconoscono i PPI come farmaci molto efficaci nella guarigione delle ulcere, nel nostro studio la gravità delle ulcere è risultata inferiore nel gruppo trattato con il farmaco rispetto al placebo. Al contrario l'esophagitis cystica profunda è risultata più frequente tra gli animali trattati. L'interpretazione di queste lesioni come carcinomatose ci avrebbe portato a ritenere erroneamente che l'incidenza di cancro fosse più alta tra i trattati, mentre un effetto del farmaco sull'incidenza di carcinomi non è dimostrato nel nostro studio. I trattamenti chirurgici antireflusso e i farmaci soppressori acidi hanno l'indicazione clinica principale di controllare i sintomi nei pazienti con MRGE. La chirurgia antireflusso offre inoltre il vantaggio di ridurre sia il reflusso acido sia quello biliare, che hanno mostrato azione sinergistica nello sviluppo di EB(9). Al contrario i PPI sono soppressori acidi. L'effetto dei PPI nella prevenzione o nell'induzione di ACE nei pazienti con MRGE o EB è controverso. Esperimenti in vivo di reflusso trattato con PPI non hanno rilevato una riduzione nel rischio di adenocarcinoma(10-12). Tuttavia uno studio recente che utilizzava un modello di esofagoduodenostomia nel ratto e confrontava i pH del reflussato ha dimostrato che il reflusso alcalino aumenta il rischio di EB, displasia e EAC, mentre un pH basso esercita un effetto protettivo in presenza di succo duodenale(13). L'acido ha dimostrato avere effetti antiproliferativi in celllule epiteliali di Barrett non neoplastico coltivate in vitro ed è stato suggerito che la prescrizione di soppressori acidi non dovrebbe superare i dosaggi necessari per il controllo dei sintomi di MRGE(14). La secrezione acida gastrica è un meccanismo fisiologico complesso e finemente regolato da vie nervose, ormonali, paracrine e intracellulari. La gastrina, l'istamina e l'acetilcolina costituiscono i maggiori stimoli per la secrezione acida, che viene principalmente inibita dalla somatostatina e in misura minore dalla colecistochinina, dal peptide natriuretico atriale e dall'ossido nitrico(15). I PPI agiscono a livello della tappa finale della secrezione acida gastrica, inattivando la pompa protonica (H+/K+ ATPasi) nella cellula parietale. Di conseguenza, l'aumento del pH intragastrico rimuove il feedback negativo per la produzione di gastrina dalle cellule G. Nei pazienti con MRGE trattati cronicamente con PPI si sviluppa perciò un quadro di ipergastrinemia. Preoccupazione è stata espressa su un potenziale ruolo della gastrina nella carcinogenesi esofagea. Studi in vitro hanno suggerito che EB sia sensibile agli effetti proliferativi della gastrina attraverso il suo recettore CCK-2R(16). Recentemente è stato proposto un ruolo antiapoptotico per la gastrina nell'EB attraverso l'up-regulation di PKB/Akt in BE e il trattamento di campioni di EB con un antagonista per CCK-2R ha dimostrato di ridurre il livello di attivazione di PKB/Akt(17). Una più profonda comprensione degli effetti dei regolatori della secrezione acida potrebbe portare allo sviluppo di nuove strategie farmacologiche per trattare la malattia da reflusso.