Analysis of the role of the homeobox transcription factor PITX2 in cardiac development: a conditional ko approach

Pitx2 is a homeodomain transcription factor expressed during embryogenesis which is crucial for the development of many organs i.e. eyes, teeth, pituitary gland and heart (Gage et al., 1999). Additionally, Pitx2 acts as the downstream mediator of the left-right pathway for imparting and maintaining “leftness” during morphogenesis of the asymmetrical organs (Levin et al., 1995; Isaac et al., 1997; Logan et al., 1998; Ryan et al., 1998). Both these actions are exerted also in the heart, which is asymmetrically patterned and where the gene is expressed from organ primordium formation and throughout all cardiac development (Campione et al., 2001). Nevertheless, how Pitx2 carries out its morphogenetic action is unknown. A good murine model to investigate the role of the gene during heart development is still missing so far. In order to dissect the myocardial role of Pitx2 we have generated a myocardial conditional Pitx2 ko mice by crossing Pitx2 floxed mice (Pitx2 loxP/loxP) (Gage et al., 1999) with TroponinT (TnT) Cre deletor mice, which display efficient myocardial Cre activity from early cardiomyogenesis (Jiao et al., 2003); in the cTP ko mice even the earliest myocardial expression of Pitx2 is prevented. The characterization of the cTP ko model is the object of this study; as the ko phenotype is not compatible with life, the work has been conducted on embryos. Hystological and magnetic resonance imaging analysis of E14.5 mutant hearts have revealed a complex set of cardiac morphological abnormalities including the typical features of the right atrial isomerism (RAI), a pathological condition in which both the atrial chambers develop the anatomical features and the venous connections of the right one; in particular bilateral sinoatrial nodes (SANs) and symmetric atrial entrance of the systemic veins have been detected. The morphological analysis has been associated to an extensive molecular characterization mainly performed by nonradioactive in situ hybridization whole mount and on section to assess the possible transcriptional modulation of developmental and functional markers expressed with regional specificity. The presence of an ectopic, left SAN and the finding of a topologically altered expression of molecules involved in the development of ventricular conduction system components prompted us to investigate the electrophysiological properties of the embryonic hearts. We approached this issue by optical mapping technique in collaboration with Prof. David Sedmera (Institute of Animal Physiology and Genetics, Prague); this tool provides epicardial membrane potential recordings with high temporal and spatial resolution, giving an ex vivo physiological readout about impulse generation and propagation in the tissue. Loss of Pitx2 expression affected ventricular morphology less dramatically than the sinoatrial region, therefore a confocal analysis has been additionally performed to investigate the ventricular phenotype at the cellular level. In the study here presented we found that: 1 cTP ko mice are a good model of RAI, since the absence of Pitx2 from the left sinoatrial region results in a bilateral “right” morphological phenotype. The cTP ko hearts recapitulate most of the abnormalities described in a previously characterized Pitx2 null model (Gage et al., 1999), including the atrial, isomeric phenotype; this last feature was absent in a myocardial specific Pitx2 ko generated with α-MHC Cre driver mice (Tessari et al., 2008) and resulting in silencing of the gene one day later than in the cTP model. Overall, these results indicate that early Pitx2 expression in myocardial cells, and not in their mesenchymal precursors, is a necessary and sufficient condition to confer “left” molecular and morphological identity to the sinoatrial region. 2 Pitx2 modulates the developmental transcriptional properties of the myocardial sleeves covering the systemic and the pulmonary venous return: loss of Pitx2 in the venous system leads to the ectopic maintenance (in caval veins) or activation (in the pulmonary myocardium) of a nodal-type genetic program including Hcn4, a potassium channel potentially sufficient to provide automaticity (Ref). Consistently, the electrophysiological properties of the atria and venous pole have been found to be dose-dependently modulated by Pitx2 expression. Therefore, Pitx2 acts not only by driving asymmetric morphogenesis of the heart, but also finely modulating the transcriptional properties of cardiac regions where it is expressed. This role can be exerted in association with the morphogenetic action or independently from it and might be potentially relevant in the light of recent findings suggesting a role for Pitx2 in atrial fibrillation (AF), pathophysiology (Gudbjartsson et al., 2007; Lubitz et al., 2010): in our opinion Pitx2 disregulation could trigger AF onset by inducing arrhytmogenic foci in caval veins and pulmonary myocardium. 3 Ventricular cTP ko myocardial cells are less elongated and have a reduced myofibrillar alignment compared to the wt; the result was not recapitulate in the atria. Therefore, Pitx2 seems to promote the cellular maturation of ventricular but not atrial cardiomyocytes; this action might drive the ventricular remodelling process which is defective in the cTP ko embryos. Concluding, Pitx2 myocardial expression acts differentially to impart a “left” molecular, morphological and functional sinoatrial identity and to drive ventricular remodelling.

Pitx2 è un fattore di trascrizione homeobox espresso durante l’embriogenesi e determinante per lo sviluppo di diversi organi tra cui gli occhi, i denti, la ghiandola pituitaria e il cuore (Gage et al., 1999). In aggiunta al suo ruolo morfogenetico , Pitx2 agisce a valle della cascata di attivazione del segnale che determina il conferimento dell’identità sinistra negli organi asimmetrici (Levin et al., 1995; Isaac et al., 1997; Logan et al., 1998; Ryan et al., 1998). Entrambe queste due azioni vengono svolte in maniera integrata durante lo sviluppo del cuore, organo asimmetrico nel quale il gene viene espresso fin dalla formazione del primordio del cuore e nel corso di tutto il suo successivo sviluppo (Campione et al., 2001). Sebbene sia chiara la centralità della funzione di Pitx2 nello sviluppo cardiaco, i meccanismi tramite i quali esso è in grado di dirigere la sua morfogenesi asimmetrica non sono stati compresi. Ad oggi, non è ancora stato ancora descritto un buon modello murino per lo studio del gene nel contesto della morfogenesi cardiaca. Per discernerne il ruolo miocardico, abbiamo quindi generato un modello murino di ko condizionale incrociando una linea di topi con l’omeodominio di Pitx2 fiancheggiato da siti LoxP (Pitx2 loxP/loxP) (Gage et al., 1999) e una linea esprimente la Cre ricombinasi sotto il controllo trascrizionale del promotore della troponina T cardiaca (TnT) (Jiao et al., 2003). I topi cTP ottenuti da questo incrocio mostrano un elevata attività della ricombinasi fin da fasi molto precoci dell’embriogenesi, che consente la completa inattivazione funzionale del gene già dai momenti iniziali della cardiogenesi. La caratterizzazione del modello cTP è stata oggetto del seguente studio; poiché i cTP ko hanno un fenotipo letale, il lavoro è stato condotto su embrioni. L’analisi istologica e mediante risonanza magnetica di cuori mutanti E14.5 ha rivelato un fenotipo complesso, composto da una serie di gravi anomalie cardiache tra cui l’isomerismo atriale destro (IAD), una condizione patologica in cui entrambi gli altri si sviluppano secondo le caratteristiche morfologiche e instaurando le connessioni venose di quello destro; questo implica, tra le altre cose, lo sviluppo di due nodi seno atriali (NSA) e l’ingresso bilaterale delle vene cave destra e sinistra nei rispettivi atri. L’analisi morfologica è stata affiancata da un’estensiva analisi molecolare condotta prevalentemente mediante ibridazione in situ non radioattiva, allo scopo di valutare eventuali alterazioni del profilo trascrizionale del modello. La presenza di un secondo nodo ectopico e l’aver verificato un’alterata espressione di marcatori di sviluppo del sistema di conduzione ventricolare ci ha suggerito di investigare le proprietà elettrofisiologiche dei cuori embrionali. A tale scopo abbiamo adottato la metodica dell’optical mapping, conducendo uno studio in collaborazione con il Prof. David Sedmera (dell’Istituto di Fisiologa Animale e Genetica di Praga); la tecnica consente la registrazione dell’attivazione elettrica dell’epicardio del cuore con un’elevatissima risoluzione spaziale e temporale e la costruzione di mappe di attivazione del segnale che riproducono dove si generi e come si propaghi l’impulso stesso. Poiché i ventricoli non mostravano alterazioni drammatiche della morfologia in assenza del gene, abbiamo infine effettuato un’analisi al confocale, allo scopo di evidenziare eventuali azioni cellulari del gene. Lo studio qui presentato ha condotto alle seguenti conclusioni: 1 I topi cTP ko sono un buon modello di IAD giacché, in assenza del gene, la regione senoatriale destra si sviluppa secondo la morfologia della sinistra. L’ IAD è uno dei tratti che rendono il fenotipo dei cuori cTP assimilabile a quello descritto in un ko costitutivo per Pitx2 caratterizzato in passato (Gage et al., 1999); l’IAD era invece completamente assente in un modello di ko condizionale generato più recentemente da Tessari et al. Tale modello differisce dal cTP per la cinetica di attivazione del promotore α-MHC che guida l’espressione della ricombinasi (Tessari et al., 2008): nei topi α-MHC, l’inattivazione di Pitx2 avviene con un giorno di ritardo rispetto ai cTP. Nel loro complesso, i nostri risultati indicano che l’espressione precoce di Pitx2 nelle cellule miocardiche, e non nei loro precursori mesenchimali, è una condizione necessaria e sufficiente per conferire identità “sinistra” alla regione senoatriale. 2 Pitx2 modula le proprietà trascrizionali del miocardio che circonda le vene cave e le vene polmonari: In assenza di Pitx2 si osserva la mancata repressione trascrizionale (nelle vene cave) o l’attivazione ectopica (nelle vene polmonari) di un programma genetico di tipo nodale, che comprende l’espressione di un canale del potassio, Hcn4, potenzialmente sufficiente a conferire autoritmicità ai tessuti (Stieber et al., 2003). In linea con tali osservazioni, l’analisi mediante optical mapping mostra che l’espressione del gene modula l’attività pacemaker del polo venoso del cuore in modo dose-dipendente. L’alterato profilo trascrizionale delle vene è un esempio di come l’attività di Pitx2 non si limiti alla morfogenesi (e quindi alla costruzione di strutture) ma si esplichi anche attraverso il conferimento di un’identità “sinistra” di tipo molecolare; la modulazione trascrizionale e l’azione morfogenetica possono essere svolte in modo concomitante e coordinato, oppure disgiunto e indipendente nel corso dello sviluppo. Le osservazioni condotte a livello delle vene dei mutanti cTP si inseriscono in un dibattito scientifico di acceso interesse circa il ruolo di Pitx2 nell’insorgenza della fibrillazione atriale (AF); alla luce di quanto osservato, la nostra opinione è che alterazioni dell’espressione di Pitx2 possano determinare l’insorgenza di attività pacemaker ectopica in vene cave e vene polmonari. La presenza di foci ectopici di attivazione elettrica rappresenta uno dei meccanismi meglio descritti nella patogenesi della fibrillazione atriale (Allessie et al., 2001; Nattel et al., 2002). 3 I cardiomiociti ventricolari ko per Pitx2 appaiono meno allungati e possiedono un minor grado di allineamento delle miofibrille rispetto ai wt; l’osservazione non è stata riporodotta in cardiomiociti atriali ko per il gene. Questo suggerisce un ruolo di Pitx2 nel processo di maturazione cellulare selettivamente svolto nei ventricoli, dove potrebbe essere implicato nell’insorgenza delle alterazioni morfologiche riscontrate nei cuori cTP ko. In conclusione, l’espressione miocardica di Pitx2 agisce in modo differenziale nelle diverse regioni cardiache: nella regione senoatriale conferisce identità morfologica, molecolare e funzionale, mentre nei ventricoli modula il rimodellamento delle camere.