Innovative technologies for the detection and control of rabies

Rabies is an acute encephalomyelitis caused by a non-segmented negative strand of RNA virus belonging to the genus Lyssavirus, part of the Rhabdoviridae family. It is transmitted to humans by rabid animals, usually after a biting event. The virus affects the central nervous system, travelling from the point of infection to the brain via the nerve cells. Viral infection of the brain is almost invariably fatal from the moment when clinical symptoms appear, and can be classified in two forms: dumb rabies, which results in the paralysis of the victim, or furious rabies, characterised by aggression, excessive saliva production and acute respiratory distress. Although international organizations have recognised the disease as being a high priority zoonosis, rabies is still widely neglected in most developing countries. The World Health Organization (WHO) annually encounters at least 10 million people receiving post-exposure treatment and 55,000 human deaths, mostly children in Asia and Africa (Knobel et al., 2005). This estimation certainly needs a more accurate investigation, since modelling on human rabies in various enzootic countries revealed a clearly higher incidence of the disease in areas under survey (Ly et al., 2009,Mallewa et al., 2007). Despite public health implications, rabies remains underestimated and diagnosed with difficulty in most endemic areas. Thus, the development of innovative diagnostic methods, as well as the study of the evolutionary dynamics of the viruses circulating in the reservoir species, is a crucial tool to both strengthen field surveillance and better plan the control programs in animals. Two molecular tests (One-Step RT-PCR) for the diagnosis of rabies and further typing through pyrosequencing have been developed in this study. Pyrosequencing is an alternative to the Sanger method of sequencing, which relies on the detection of a released pyrophosphate molecule during the DNA synthesis (Ronaghi & Elahi., 2002). The protocols developed in this study target on two different genes, namely the genes encoding for the viral nucleoprotein (N) and for the viral glycoprotein (G). The first protocol (targeting the N gene) was mainly developed to rapidly identify a Lyssavirus responsible for the infection in field samples and is applicable to both human and animal specimens; the second protocol (targeting the G gene) was developed to differentiate a vaccine strain from a field (wild) rabies strain. The latter protocol has also been applied to field samples collected from areas subject to oral vaccination of foxes with live attenuated vaccines during the Italian recent epidemic (2008-2011). The molecular and evolutionary dynamics of rabies viruses circulating in West and Central Africa and more recently in North-eastern Italy have been investigated in this study. The phylogenetic analyses have been performed Maximum Likelihood methods (as implemented in PAUP* and PhyML) (Wilgenbusch & Swofford., 2003, Guindon & Gascuel., 2003). The evolutionary dynamics as well as the phylogeography of the obtained sequences have been inferred using the Bayesian Markov Chain Monte Carlo (MCMC) method available in the BEAST package (Drummond & Rambaut., 2007). In a first study, viruses circulating in West and central Africa were analysed. Findings from this study confirm that a specific sub-lineage, called Africa 2, is circulating in the regions under survey. This sub-lineage was introduced approximately in 1845, most probably through the human-associated dispersal (i.e. the French colonization of the region). This study identified a strong geographical clustering of RABV sequences, which indicates a little transboundary spread of the infection. A second study focused on viruses circulating in North-Eastern Italy. Findings from this study confirm that such strains fall into the Western European sublineage of the Cosmopolitan clade. Two genetic groups have been identified in Italy in the recent 2008-2011 epidemic, mainly distributed in two geographical areas. Viruses belonging to both clades have high similarity with those circulating in the Western Balkans, particularly Bosnia-Herzegovina, Croatia and Slovenia. Results from the evolutionary analyses strongly suggest the occurrence of two separate introductions in the same geographical area.

La rabbia è un encefalomielite acuta causata da virus a singolo filamento di RNA a polarità negativa appartenenti al genere Lyssavirus, parte della famiglia Rhabdoviridae. Il virus si trasmette all’uomo da animale infetto, generalmente mediante morso. Il virus infetta il sistema nervoso centrale, mediante colonizzazione centripeta delle cellule nervose. L’infezione virale del sistema nervoso centrale è fatale nella maggioranza dei casi e dall’inizio della sintomatologia, che può essere catalogata in due forme: rabbia paralitica che determina la paralisi progressiva della vittima, o rabbia furiosa caratterizzata da aggressività, ipersalivazione ed insufficienza respiratoria acuta. Benchè le organizzazioni internazionali abbiano classificato tale malattia come una zoonosi altamente prioritaria, la rabbia è ancora trascurata nella maggiorparte dei Paesi in via di sviluppo. L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) calcola che ogni anno almeno 10 milioni di persone ricevano il trattamento post-esposizione e stima una perdita di almeno 55.000 vite, la maggiorparte bambini in Asia e Africa (Knobel et al., 2005). Queste stime necessiterebbero sicuramente ulteriori conferme, alla luce dei risultati di diversi studi di modelling dei casi di rabbia altamente indicativi di un’incidenza superiore della malattia (Ly et al., 2009,Mallewa et al., 2007). Nonostante le gravi implicazioni per la salute pubblica, la rabbia rimane nella maggiorparte dei casi, sottostimata e poco diagnosticata nelle aree endemiche. A tal proposito, lo sviluppo di metodiche diagnostiche innovative, cosìccome lo studio delle dinamiche evolutive dei virus circolanti nelle specie reservoir della malattia, sono due strumenti utili sia per aumentare la sorveglianza sulla malattia sia per pianificare suoi nterventi di controllo. Il candidato ha sviluppato due test biomolecolari per la diagnosi della rabbia (One-Step RT-PCR) e la sua tipizzazione mediante l’utilizzo del pyrosequenziamento. La tecnica del pyrosequenziamento è una metodica alternativa al sequenziamento Sanger, che si basa sull’identificazione di una molecola di pirofosfato nel processo di sintesi del DNA (Nyren., 2007). Le due metodiche sono state sviluppate su due geni differenti del virus rabbia, N e G (codificanti per la nucleoproteina e per la glicoproteina rispettivamente). Nel primo caso, il protocollo ha permesso di identificare la specie virale responsabile dell’infezione, nel secondo invece di riconoscere la presenza di un virus vaccinale da un virus di campo. In particolare, la seconda metodica è stata applicata ai campioni risultati positivi per virus rabbia durante la recente epidemia in Nord Est Italia (2008-2011), durante la quale si è proceduto a vaccinazione orale delle volpi, mediante la distribuzione di esche vaccinali contenenti vaccino vivo attenuato. Le dinamiche epidemiologico-molecolari e le dinamiche evoluzionistiche dei virus rabbia circolanti nella regione centro-occidentale della Africa e più recentemente in Italia sono state affrontate durante la scuola di dottorato dal candidato. Le analisi filogenetiche si sono avvalse dei metodi massima verosimiglianza (programmi PAUP* e PhyML) (Wilgenbusch & Swofford., 2003, Guindon & Gascuel., 2003). Sono state inoltre analizzate le sequenze ottenute mediante Bayesian Markov Chain Monte Carlo (MCMC) disponibile nel programma BEAST (Drummond & Rambaut., 2007) per calcolare le dinamiche evolutive dei virus. Nel primo caso sono stati analizzati i virus circolanti nella regione centro-occidentale Africana. Lo studio ha dimostrato che i virus della rabbia circolanti nella popolazione canina dell’Africa Sub-Sahariana Occidentale e Centrale appartengono ad uno specifico sublineaggio detto Africa 2 Le analisi hanno dimostrato come questo specifico lineaggio sia stato verosimilmente introdotto in Africa in epoca relativamente recente (molto probabilmente 1845) e verosimilmente mediante il movimento di animali associati all’uomo (p.e. durante la colonizzazione francese della regione). Una forte caratterizzazione in cluster genetici circoscritti è inoltre indicativa di una circolazione relativamente limitata tra i Paesi all’interno della regione. Le sequenze dei virus rabbia responsabili della recente epidemia nel Nord-Est (2008-2011) sono state inoltre analizzate. I risultati ottenuti indicano che i virus responsabili della recente epidemia di rabbia silvestre appartengono al lineaggio Europeo Occidentale del clade Cosmopolita. In particolare, è stato possibile individuare due sub-clades virali con due pattern geografici distinti. Entrambi i sub-clades presentano un’elevata omologia con i ceppi circolanti nei Balcani in particolare nelle aree confinanti dell’ex-Yugoslavia e le analisi evoluzionistiche effettuate sono fortemente indicative di una duplice introduzione degli stessi in un’area ed in un arco temporale ristretti.