Identification of novel loci and genes involved in Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy

Introduction: Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) is an inherited cardiac disease characterized by fibrofatty replacement of myocardial tissue and high incidence of serious ventricular tachyarrhythmias. To date, ten disease-genes have been identified, five of which encoding desmosomal proteins (PKP2, DSP, DSG2, DSC2 and JUP). Aim of the study: The study described in the present thesis aimed at determining the spectrum and prevalence of desmosomal mutations in 80 Italian unrelated index cases. Moreover, the identification of novel disease loci and genes in three ARVC families was attempted by integrating different approaches, including genome-wide linkage study, Copy Number Variations (CNVs) analysis, and exome-sequencing. Methods: Mutation screening of the desmosomal ARVC genes was performed by Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC) and direct sequencing. In order to map novel loci and, possibly, to identify novel genes, genome-wide linkage study and CNVs analysis was performed in three independent families with recurrence of ARVC, showing no mutations in any of the desmosomal genes. In addition, in Family #2 and in Family #3 a combined strategy of linkage analysis and exome sequencing was adopted to identify novel ARVC genes. Results: Mutation screening of five desmosomal ARVC genes in 80 Italian probands identified single point mutations in 32.5% of cases and multiple mutations in 12.5%. No mutations were identified in the remaining 55% of probands. The genes most frequently involved were PKP2, DSP and DSG2. Among the index cases negative for point mutations in the desmosomal genes, three belong to independent families with recurrence of ARVC. Assuming a further genetic heterogeneity in these families, a genome-wide scan was performed in order to identify novel loci and genes. In Family #1, a CNV involving a desmosomal ARVC gene was identified in all affected family members. In Family #2, a novel ARVC locus was mapped on chromosome 19 by linkage analysis. Finally, in Family #3, a possible novel candidate gene for ARVC was detected by a combined strategy of linkage analysis and exome-sequencing. Discussion: In the present study, genetic screening of five desmosomal ARVC genes in 80 Italian probands identified causative mutations in 45% of cases, mainly involving the “big3” genes PKP2, DSP, and DSG2, according to data reported in literature. Genetic analysis of available family members confirmed the high heterogeneity in the clinical expression of ARVC mutations even among relatives. Mutation screening of desmosomal genes failed to detect causative mutations in more than 50% of index cases, suggesting that additional and still unknown genes could be involved. In this perspective, a genome-wide scan was performed in three large ARVC families, showing no mutations in any of the desmosomal genes. In Family #1, a CNV was identified in a desmosomal ARVC gene, highlighting the importance of complementing the conventional mutation screening in ARVC genes with other approaches able to detect possible structural variations. In Family #2, genome-wide linkage results provided strong evidence for a novel ARVC locus on chromosome 19, highlighting the soundness of this strategy for identifying susceptibility regions in large, highly informative families and providing the basis for the identification of a novel disease gene. Finally, in Family #3, exome-sequencing identified a novel putative candidate gene for ARVC. Identification of novel ARVC genes is of great importance for understanding the molecular pathogenesis of this disease, as well as for increasing the power of genetic screening and developing successful targeted therapies

Introduzione: La Cardiomiopatia Aritmogena del Ventricolo Destro (ARVC) è una malattia ereditaria del muscolo cardiaco caratterizzata dalla progressiva perdita e sostituzione fibro-adiposa dei cardiomiociti che costituiscono la parete libera delventricolo destro. Tale disomogeneità del tessuto cardiaco altera la normale conduzione dell'impulso elettrico, determinando l'insorgenza di aritmie che occasionalmente portano a fibrillazione ventricolare e morte improvvisa per arresto cardiaco, soprattutto nei giovani e negli atleti. Attualmente, sono noti 10 geni implicati nella determinazione genetica dell’ARVC e cinque di questi codificano per proteine costituenti il desmosoma cardiaco: Placofilina-2 (PKP2), Desmoplachina (DSP), Desmogleina-2 (DSG2), Desmocollina-2 (DSC2) e Placoblobina (JUP). Scopo dello studio: Lo studio descritto nella presente tesi mira a valutare la prevalenza e lo spettro di mutazioni nei cinque geni ARVC desmosomali in un gruppo di 80 casi indice Italiani, non imparentati tra loro. Inoltre, in tre grandi famiglie con ricorrenza di casi ARVC e in cui non sono state identificate mutazioni nei geni desmosomali, è stata effettuata un'analisi genome-wide integrando diversi approcci, quali studio di linkage, analisi di Copy Number Variations (CNVs) e sequenziamento dell’esoma. Metodi: Lo screening per la ricerca di mutazioni nei cinque geni ARVC desmosomali ha coinvolto 80 casi indice ed è stato effettuato tramite analisi DHPLC (Denaturing High-Performance Liquid Chromatography) e sequenziamento diretto del DNA.I soggetti appartenenti a ciascuna delle tre famiglie selezionate per l'analisi genome-wide sono stati genotipizzati utilizzando un pannello di marcatori ad alta densità che include più di 370.000 polimorfismi di singolo nucleotide (SNPs) (Illumina HumanCNV370-Duo BeadChip). In ciascuna famiglia è stato effettuato uno studio di linkage ed un’analisi di CNVs. Inoltre, Nella Famiglia #2 e nella #3 l'identificazione del gene malattia è stata tentata integrando i risultati dello studio di linkage con i dati ottenuti dal sequenziamento dell'esoma di due soggetti affetti. Risultati: L'analisi delle sequenze codificanti dei geni PKP2, DSP, DSG2, DSC2 e JUP in 80 casi indice Italiani ha permesso di identificare mutazioni singole nel 32.5% dei casi e mutazioni multiple nel 12.5%. Il 55% dei probandi non è risultato portatore di alcuna mutazione nei geni desmosomali. La maggior parte delle mutazioni ha coinvolto i geni PKP2, DSP, DSG2, confermando i dati riportati in letteratura. Tra i casi indice in cui non sono state identificate mutazioni nei geni desmosomali, tre appartengono a famiglie indipendenti con ricorrenza di casi ARVC. In ognuna di queste famiglie è stata effettuata un'analisi genome-wide allo scopo di identificare nuovi loci e geni malattia. Nella Famiglia #1 è stata identificata una CNV che coinvolge uno dei geni ARVC desmosomali noti e co-segrega con il fenotipo patogeno. Nella Famiglia #2, l’analisi di linkage ha permesso di identificare un nuovo locus ARVC sul cromosoma 19. Infine, nella Famiglia #3 è stato identificato un nuovo potenziale gene candidato per l’ARVC. Discussione: L’analisi genetica delle sequenze codificanti dei cinque geni ARVC desmosomali, in un gruppo di 80 probandi italiani, ha permesso di identificare mutazioni nel 45% dei casi, confermando il prevalente coinvolgimento dei tre geni PKP2, DSP e DSG2, in accordo con i dati riportati in letteratura. L'analisi genetica dei familiari dei probandi ha confermato la penetranza incompleta e l'espressività variabile della malattia, anche all'interno della stessa famiglia. L'assenza di mutazioni in più del 50% dei casi suggerisce il coinvolgimento di altri geni nella determinazione genetica dell'ARVC. In quest' ottica, un'analisi genome-wide è stata effettuata in tre famiglie con ricorrenza di casi ARVC e in cui non sono state individuate mutazioni nei geni desmosomali. Nella Famiglia #1, l’identificazione di una CNV in uno dei geni ARVC desmosomali, presente in tutti i soggetti affetti, sottolinea l'importanza di associare alle metodiche tradizionali utilizzate per lo screening di mutazioni puntiformi approcci che permettano di identificare eventuali variazioni strutturali presenti nel genoma. Nella Famiglia #2, l'analisi di linkage ha fornito una significativa evidenza dell'esistenza di un nuovo locus ARVC sul cromosoma 19, fornendo le basi per l'identificazione di nuovi geni. Infine, nella Famiglia #3, il sequenziamento dell'esoma di due soggetti affetti ha identificato un nuovo gene come un possibile candidato per l'ARVC