Micro-engineered skeletal and cardiac muscle for Duchenne muscular dystrophy in vitro models

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common and severe genetic neuromuscular disorder affecting both skeletal and cardiac muscle functionality. More than twenty years have passed since the identification of the dystrophin gene, which mutations cause the disease. Many progresses have been made in understanding the pathogenesis and different experimental strategies has been tested both in vitro, on bench-top cell cultures, and in vivo, on different animal models. So far, despite some promising outcomes coming from recent clinical trials, this has not resulted in an effective and definitive cure significantly altering the relentless progression of this disease, which has still a 100% mortality rate. In this context, the aim of this PhD thesis is the development of micro-engineered human skeletal and cardiac muscles representing in vitro models of DMD patient tissues useful for testing therapeutic approaches aimed at restoring a proper dystrophin expression. The strategy applied for the obtainment of such human in vitro models rely on the application of micro-scale technologies for reproducing in vitro the main physiological cues that guide differentiation and allow functionality of skeletal and cardiac muscles in vivo. In particular, the mechanical properties of the cell micro-environment and the topologic organization over the cell culture were optimized for both skeletal and cardiac muscle. Such micro-scale technologies were coupled with an appropriate human cell source. Human primary myoblasts from biopsies of DMD patient were used for skeletal muscle engineering, while DMD patient-specific cardiomyocytes were differentiated from human pluripotent stem (hiPS) cells for modeling the cardiac muscle. Both the obtained DMD in vitro models were validated for testing the ability of different therapeutic approaches in restoring dystrophin expression. In particular, three different myogenic cell types were tested on the engineered DMD skeletal muscle, while dystrophin expression restoration by a human artificial chromosome carrying the full-length genomic dystrophin sequence was tested on hiPS cells-derived cardiomyocytes. In these perspectives, the developed human in vitro models can represent a useful platform for performing preliminary or pre-clinical tests of different therapeutic strategy for DMD. In addition, they can be used as complementary tool in a clinical trial, for test different batches of cells before using them on patients.

La distrofia muscolare di Duchenne è una delle più frequenti e severe patologie genetiche neuromuscolari che affliggono la funzionalità del muscolo scheletrico e cardiaco. Il gene codificante la distrofina, proteina la cui mutazione è alla base della patologia, è stato scoperto più di vent’anni fa. Da allora, notevoli progressi sono stati compiuti nella comprensione della patogenesi di questa malattia e diverse strategie sperimentali volte al suo trattamento sono state testate, sia in vitro su convenzionali colture cellulari che in vivo su diversi animali modello. Tuttavia, eccezione fatta per alcuni promettenti risultati recentemente ottenuti in trials clinici, ad oggi non vi è ancora una cura efficace e definitiva in grado di alterare o rallentare la progressione di questa patologia, il cui tasso di mortalità è pari al 100%. In tale contesto, lo scopo di questa tesi di dottorato è quello di sviluppare dei modelli in vitro micro-ingegnerizzati di muscolo scheletrico e cardiaco umano, che siano rappresentativi dei tessuti distrofici e dunque utili per testare approcci terapeutici volti al ripristino dell’espressione di distrofina. La strategia applicata per l’ottenimento di tali modelli si basa sull’applicazione di tecnologie su microscala per riprodurre in vitro i principali stimoli che guidano il differenziamento e consentono la funzionalità del muscolo scheletrico e cardiaco in vivo. In particolare, le proprietà meccaniche del micro-ambiente e l’organizzazione topologica della coltura cellulare sono stati ottimizzati sia per il muscolo scheletrico che cardiaco. Tali tecnologie su micro-scala sono state accoppiate con un’appropriata fonte cellulare umana. Per l’ingegnerizzazione del muscolo scheletrico sono stati utilizzati mioblasti umani primari derivanti da biopsie di pazienti DMD mentre, per la modellazione del muscolo cardiaco, cellule umane pluripotenti indotte (iPS) sono state differenziate in cardiomiociti paziente-specifici. Entrambi i modelli in vitro di muscolo distrofico ottenuti sono stati validati testando l’abilità di diversi approcci terapeutici nel ripristinarne l’espressione di distrofina. In particolare, tre diversi tipi cellulari miogenici sono stati testati nel muscolo scheletrico distrofico ingegnerizzato. Inoltre, nei cardiomiociti distrofici derivanti da cellule iPS è stato testato il ripristino dell’espressione di distrofina per mezzo di un cromosoma artificiale portante la sua completa sequenza genomica. Da tali risultati emerge come i modelli umani in vitro sviluppati in questo lavoro possano rappresentare un’utile piattaforma su cui effettuare test pre-clinici preliminari di diverse strategie terapeutiche. Inoltre, essi posso potenzialmente essere utilizzati come strumento complementare durante i trials clinici, per testare, ad esempio, diverse preparazioni di cellule destinate al paziente.