Chiral discrimimation and structural analysis of organic molecules by nmr in oriented polypeptide solutions: a computational investigation

NMR spectroscopy in liquid crystal solutions of polypeptides has been used for almost two decades, and has been shown to be a useful technique for the structure determination and the chiral discrimination of organic solutes. However the underlying mechanism remains largely unknown and there are several open questions. They concern the nature of the forces which control the anisotropic distribution of solutes: are there specific interactions, like hydrogen bonds, which involve selected chemical groups? Also the effects of co-solvent and temperature are scarcely understood: do they control the polypeptide-solute interactions or do they play an indirect role, by affecting the structure of the polypeptide? The lack of knowledge is a limit for the full exploitation of the NMR technique in liquid crystals. A deeper insight would be important to guide the optimization of the working conditions, e.g. by a proper selection of the polypeptide/co-solvent pair, given the nature of the solute. Especially challenging is the phenomenon of chiral discrimination. It occurs because pairs of enantiomers interacting with chiral polypeptides form diastereoisomeric pairs, but the forces relevant to this purpose are not known. In this thesis the behaviour of solutes in ordered solutions of poly(γ-benzyl-glutamate) (PBG) has been investigated using computational methods. The theoretical work has been carried out in close connection with experimentalists, from the laboratory of the Laboratoire de RMN en Milieu Orienté, Institut de Chimie Moléculaire d’Orsay de l’Université de Paris Sud, 11 (ICMMO) where a peculiar expertise in NMR techniques in liquid crystal media has been developed. Theoretical results have been checked against NMR data; moreover, new measurements have been performed in parallel with the computational study, to control the consistency of theoretical and experimental results. A major objective of this thesis has been the development of new computational tools for the analysis of experimental data, with the two-fold purpose of (i) helping the spectral interpretation and (ii) extracting the structural information which is contained in experimental data. In this thesis we have explicitly considered natural abundance deuterium (NAD) 2D-NMR experiments, so we have focussed on 2H-quadrupolar splittings; however the methods used here could be extended to other kinds of magnetic interactions. We have used different approaches to address the problems of chiral discrimination and structure determination. Chiral discrimination has been studied by fully atomistic Molecular Dynamics (MD) simulations. This level is needed, since the difference of orientational order, and then the spectral differences, between enantiomers is extremely small and depends on details of the intermolecular potentials. This is a general feature of chiral properties, which result from a subtle balance of energetically comparable contributions. This study had first of all an explorative purpose: it had to be assessed whether methods based on empirical intermolecular potentials could provide reliable information on chiral properties. A few solutes were investigated, but most of the work focussed on the prochiral molecule benzyl alcohol (BZA), which was found to be particularly appropriate for two main reasons. First, it exhibits a large difference in the 2H quadrupolar splittings of the two enantiotopic directions; moreover, it can be used as co-solvent, and this can be to improve the sampling efficiency in MD simulations. The problem of structural analysis is comparably less delicate, because the experimental differences in orientational order between molecules with different chemical structure are relatively larger. From the theoretical point of view, this means that approximate models can be developed, which are useful to rationalize the mechanism of solute ordering. Moreover, the availability of less demanding approaches, able to provide reliable predictions of order parameters, and then patterns of 2H-NMR splittings, at a relatively low computational cost, is essential for the development of computational tools to be used in connection with experiments. The thesis is divided in two parts. The first part is dedicated to the problem of structure analysis. In chapter 3 the so called tube model will be presented, for the calculation of the deuterium quadrupolar splittings of a solute on the basis of its chemical structure, under the assumption of simple steric repulsions with the polypeptide. The subsequent chapter 4 illustrates the computational methodologies which have been developed to predict the deuterium quadrupolar splitting profiles for flexible solutes, using the tube model coupled with suitable sampling of molecular conformations. Chapter 5 reports the experimental and theoretical study of a series of saturated fatty acid methyl esters (C14 –18). Chapter 6 presents a systematic study of saturated, unsaturated and conjugated fatty acid methyl esters and shows how torsional parameters can be extracted from the 2H quadrupolar splitting profiles. The second part of the thesis deals with chiral discrimination. In chapter 7 the results of a series of NAD 2D-NMR experiments on BZA, carried out at the ICMMO will be summarized. Then, chapter 8 is dedicated to Molecular Dynamics simulations. First the preliminary study of PBLG in chloroform will be presented, which was used to validate the parameterization of the force field for this polypeptide. Then, the results obtained for BZA in binary and ternary mixtures will be reported.

La spettroscopia NMR in soluzioni liquido cristalline di polipeptidi è utilizzata da una ventina d’anni e si è rivelata applicabile con ottimi risultati, sia per la determinazione strutturale, si per la discriminazione chirale di molecole organiche. Tuttavia il meccanismo che ne sta alla base rimane poco chiaro e ci sono molte questioni irrisolte. Queste riguardano la natura delle forze che controllano la distribuzione anisotropica dei soluti; non si conosce, ad esempio, quale possa essere il ruolo di interazioni specifiche, come legami idrogeno. Inoltre gli effetti del cosolvente e della temperatura non sono chiari, non si è capito se incidano direttamente sulle interazioni soluto-peptide oppure se abbiano un effetto indiretto, andando a modificare la struttura del polipeptide stesso. La scarsa comprensione costituisce un limite che impedisce di sfruttare appieno le potenzialità della tecnica NMR in cristalli liquidi. Una maggiore padronanza del fenomeno sarebbe un importante punto di partenza per ottimizzare le condizioni di lavoro; ad esempio si potrebbe scegliere con più cognizione il sistema peptide-cosolvente ideale per un determinato soluto. Un aspetto particolarmente interessante riguarda la discriminazione chirale: si sa che avviene perché l’interazione di coppie di enantiomeri con i polipeptidi chirali origina coppie di diastereoisomeri, ma non è noto quali forze ne siano responsabili. In questa tesi si è studiato il comportamento di soluzioni liquido-cristalline di poli(γ-benzil-glutammato) utilizzando metodi computazionali. Il lavoro teorico è stato svolto in collaborazione con un gruppo sperimentale del laboratorio del Laboratoire de RMN en Milieu Orienté, Institut de Chimie Moléculaire d’Orsay de l’Université de Paris Sud, 11 (ICMMO), che ha sviluppato una competenza specifica nelle tecniche NMR in fasi di cristallo liquido. I risultati teorici sono stati confrontati con quelli dati NMR; inoltre, in parallelo ai calcoli, sono stati eseguiti nuovi esperimenti, in modo tale da controllare la consistenza tra risultati teorici e sperimentali. Uno degli obiettivi principali della tesi è stato quello di sviluppare nuovi strumenti computazionali per l’analisi dei dati sperimentali con il duplice scopo di (i) essere un supporto per l’interpretazione spettrale e (ii) estrarre le informazioni strutturali contenute nei dati sperimentali. Nella tesi si è fatto esplicito riferimento a esperimenti in abbondanza naturale di deuterio (NAD 2D-NMR), perciò ci si è focalizzati su splitting quadrupolari di deuterio; tuttavia i metodi utilizzati possono essere estesi ad altri tipi di interazioni amgnetiche. Si sono utilizzati approcci diversi per affrontare il problema della discriminazione chirale e quello dell’analisi strutturale. I meccanismi che portano a discriminazione chirale sono stati investigati attraverso simulazioni di Dinamica Molecolare (MD) a livello atomistico. La scelta è stata dettata dalla constatazione che le differenze di ordine orientazionale, e quindi le differenze spettrali, tra coppie di enantiomeri sono molto piccole e possono dipendere da dettagli delle interazioni intermolecolari. Questa è una caratteristica fondamentale delle proprietà chirali, che sono il risultato di un bilanciamento delicato di contributi energetici di entità comparabile comparabili. Innanzitutto lo studio ha avuto uno scopo esplorativo: si è voluto valutare se metodi basati su potenziali intermolecolari empirici possano fornire informazioni affidabili di proprietà chirali in fase condensata. Sono stati studiati alcuni soluti, ma la maggior parte del lavoro si è concentrata sull’alcol benzilico (BZA), una molecola prochirale che si è rivelata particolarmente adatta allo scopo per più di un motivo. Innanzitutto essa presenta una differenza relativamente grande tra gli splitting quadrupolari di deuterio per le due direzioni enantiotopiche; inoltre ha il vantaggio di potere essere usata come solvente, e questo permette di aumentare l’efficienza del campionamento nelle simulazioni MD. Per quanto riguarda la determinazione strutturale, il problema è meno delicato in quanto le differenze sperimentali tra i parametri d’ordine di molecole con strutture diverse sono relativamente più grandi. Ciò significa che dal punto di vista teorico è possibile sviluppare modelli approssimati, che sono utili per razionalizzare il meccanismo alla base dell’ordine dei soluti. Inoltre la possibilità di mettere a punto approcci in grado di fornire stime dei parametri d’ordine, e quindi pattern di splitting quadrupolari, a un costo computazionale non troppo elevato, è essenziale per lo sviluppo di metodologie integrate con gli esperimenti. Questa tesi è quindi sviluppata in due parti. Nella prima parte ci si è concentrati sul problema della determinazione strutturale. Nel capitolo 3 viene presentato il modello del cilindro rigido, che permette di calcolare gli splitting quadrupolari di un soluto sulla base della sua struttura, partendo dall’ipotesi che le interazioni soluto-polipeptide siano essenzialmente di tipo sterico. Nel capitolo 4 sono riportate le metodologie computazionali sviluppate per il calcolo dei profili di splitting quadrupolari di soluti flessibili, utilizzando il modello del cilindro rigido accoppiato con un campionamento adeguato dello spazio conformazionale. Nel capitolo 5 si trova l’applicazione di questo metodo ad una serie di esteri metilici di acidi grassi saturi (C14-C18). Il capitolo 6 riporta uno studio sistematico di esteri di acidi grassi saturi, insaturi e insaturi coniugati, nel quale si mostra come i parametri torsionali possono essere estrapolati dal profilo degli splitting quadrupolari. La seconda parte della tesi riguarda la discriminazione chirale. Nel capitolo 7 si riportano i risultati di una serie sistematica di esperimenti NMR sull’alcol benzilico, condotti presso i laboratori dell’ICMMO. Il capitolo 8 è invece dedicato alle simulazioni di Dinamica Molecolare. Innanzitutto viene presentato uno studio preliminare sul PBLG in cloroformio, eseguito per validare la parametrizzazione del campo di forze utilizzato per questo polipeptide. Quindi sono riportati i risultati ottenuti per l’alcol benzilico in miscele liquido-cristalline binarie e ternarie.