Solution structure determination of two glutaredoxins of trypanosoma brucei

ABSTRACT Glutaredoxins (Grxs) are glutathione-dependent oxidoreductases that belong to the so called Thioredoxin fold super-family, together with Thioredoxins (Trxs), Disulfide Oxidoreductases (Dsbs), Glutathione Transferases (GSTs), Peroxiredoxins (PRXs), Glutathione Peroxidases (GPXs) and Nucleoredoxins (NRXs). They are ubiquitous enzymes, being conserved throughout all the kingdoms of life from viruses to eukaryotes, and take part in a wide variety of biological processes. Grxs were first described as partners of ribonucleotide reductase (Holmgren A., 1976), a protein essential for the biosynthesis of deoxyribonucleotides, later on they were found to play a role in the reduction of dehydroascorbate to ascorbate, to be involved in the binding reactivation for some transcription factors to DNA and, in the case of Human Grx1, to be pivotal for the regulation of the activity of HIV-1 protease in vitro. Lately, an increasing number of papers point up the role of Grxs in the cellular iron homeostasis, since it was demonstrated their ability in building up, storing, and transferring [2Fe2S] type Iron Sulfur Clusters (ISCs), suggesting that Grxs are involved in the assembly of metalloproteins and/or act as Iron sensors (Rouhier et al., 2010). More in general, Glutaredoxins, together with the tripeptide glutathione (γ-glutamyl-cysteinyl-glycine) and Glutathione Reductase, are known to maintain the intracellular redox state, protecting the cell from reactive oxygen species (ROS) and modulating the reactivity of Cysteine-containing substrates through the formation or the reduction of disulfides bonds. Both intramolecular disulfide bonds between proteins as well as intermolecular bonds formed by a protein cysteinyl moiety and a low molecular weight thiol (also known as mixed disulphides) are typical substrates of this class of enzymes. From the structural point of view, Grxs are generally small, globular proteins (9-14 kDa) showing a highly conserved structural motif, the thioredoxin fold, that in its most simplified pattern consists of a four β-strand core surrounded by three α-helices. A first classification of Grxs into subclasses was done on the basis of the variability of the active site and their different biochemical behaviour (Herrero, E. et al., 2007): classical glutaredoxins v have in most cases a dithiol CP(Y/F)C active site, even if non-canonical C(S/G)(Y/F)C sequences were found, while a second distinct class was shown to contain a more conserved monothiol CGFS active site. Recently, comparative genomic analyses led to a further classification into six classes, being the first two classes the most important ones (Rouhier et al., 2010): class I collects all the single domain monothiol and dithiol Grxs in which a CPY[C/S], CGYC, CPFC or CSY[C/S] is found; class II contains all the highly conserved CGFS type Glutaredoxins, both single domain and multi domain fusion proteins. It was suggested though that single and multi domains Grxs should be put into distinct functional groups (Hoffmann, B.H. et al., 2010). The remaining classes are restricted to some particulare kingdoms (higher plants, eukaryotic photosynthetic organisms and cyanobacteria respectively). In this work we focused our attention on two monothiol glutaredoxins of Trypanosoma brucei, Tb-Grx1 and Tb-Grx3. Tripanosomatids are parasitical protozoa of the phylum Kinetoplastida and they're known to be the causative agents of some pathologies spread throughout the tropical areas of the South American (Chagas' disease) and African (Human sleeping sickness and Nagana cattle disease) continents. Trypanosomes encode three monothiol glutaredoxins: Grx1 and Grx2 are localized in the kinetoplast, the rudimentary mitochondrion-like organelle typical of flagellate protozoa, the former being a homodimeric protein found at a concentration as high as 5µM. On the contrary Grx3 is the only cytosolic monothiol glutaredoxin known for these organisms, and has the peculiarity of being a two-domain fusion protein, in which a C-terminal glutaredoxin is linked by a sequence of ten non conserved residues to a thioredoxin N-terminal domain (Filser, M. et al., 2008). In both Grx1 and Grx3 the active sites diverge from the typical conserved pattern described above for monothiol glutaredoxins, the former being characterized by a CAYS sequence and the latter by CGFT residues. The biochemical roles of these proteins are still under study, even if it is remarkable the lack of activity for Grx1 towards the common reduction assays, differently from Grx3 which is able to reduce both inter and intramolecular disulfide bridges; furthermore, in both cases, it was observed the reconstitution of [2Fe2S] ISCs in vitro. By solving the solution structures of these two enzymes and by studying the backbone dynamics via NMR, we aimed to shed light on their biochemical properties and more in general on their roles in the redox and Iron metabolism machineries of the Trypanosomatids. Moreover, since it was demonstrated that Tb-Grx1 is fundamental for the parasite survival vi (Manta, B. et al., unpublished), obtaining its structure is necessary in order to perform a structure driven drug discovery for the development of a new class of drugs targeting the diseases above mentioned. Finally, due to their peculiarities of being a homodimeric and a two-domain fusion protein respectively, the structural determination of Tb-Grx1 and Tb-Grx3 can be helpful in the classification of the glutaredoxins on the basis of their reactivity, their tertiary and, if present, quaternary structure. At the time of writing (January, 2012), there are only six either solution or crystal structures deposited in the Protein Data Bank identified as monothiol glutaredoxins, and all of them are known to be single-domain and monomeric proteins. To accomplish these aims, it was necessary to set up optimal strategies that take into account the supramolecular features unique to Tb-Grx1 and Tb-Grx3. Since the ab initio determination of the structure of a homodimer in solution can be cumbersome, a first simplification supported by preliminary biochemical experiments (Manta et al, unpublished) consisted on the study of the globular part of the protein and the putative dimerization domain as distinct moieties. The structure of the globular part of Grx1 was solved by the routine method exploiting nuclear Overhauser effect (NOE) derived distance restraints between couples of hydrogens. In particular, it was necessary to obtain a 13C-15N isotopically labeled protein in order to identify the resonance frequencies and to assign them respectively to the backbone and side-chains heteroatoms and to the amidic, aliphatic and aromatic hydrogens. For achieving this, the standard 3D backbone assignment experiments were used in their TROSY (Pervushin, K., et al, 1997) and BEST (Lescop, E. et al., 2007) variants, for improving spectral resolution and sensitivity but minimizing the acquisition time. The side-chains resonances and the NOE distance restraints used by the software Cyana (Herrmann, T. et al., 2002a and 2002b) for the structure calculation were obtained exploiting the standard 3D TOCSY and NOESY based experiments. The putative dimerization domain, consisting of 28 aminoacids, was instead obtained through chemical synthesis, and preliminarily studied via Circular Dichroism. To understand the modality of dimerization, its interaction with the Grx1 globular domain was studied observing and mapping the chemical shift perturbations from the 2D HSQC spectra of the 15N isotopically labeled protein. On the other hand, Tb-Grx3 is a two-domain 24 kDa protein, thus unsuitable for routinary NMR structure determination: NOE based distance restraints in the range of 1-5Å vii are both difficult to obtain in a relevant number from the crowded spectra that usually come together with a macromolecule of such a molecular weight and, even in the favorable case in which inter-domain distances were found, such restraints aren't sufficient to determine the mutual orientations of the domains, given that there are no internal dynamics involving the two moieties. For this reason we have developed a method for calculating a reasonable low resolution structure exploiting few and easy-to-acquire NMR-based experimental restraints, like backbone chemical shifts, from which it is possible to obtain the respective Ψ,Φ dihedral angles, and residual dipolar couplings (RDCs) that, by giving informations about the mutual orientations of couples of atoms, are thus the method-of-choice for determining the mutual orientation of the protein domains. In particular, the entire process was composed by a first step in which the two domains were obtained independently as isolated homology models and refined against the experimental data (Chou, J.J. et al., 2000), followed by a reconstitution of the whole protein and a rigid body docking (Schwieters, C.D. et al., 2010) driven by RDCs and Small Angle X-Ray Scattering (S.A.X.S.) curve analysis, thus providing at the same time both the domain mutual orientation and the shape of the whole macromolecule.

SOMMARIO Le Glutaredosine (Grxs) sono ossidoriduttasi glutatione-dipendenti che appartengono alla super-famiglia strutturalmente caratterizzata dal cosiddetto “Thioredoxin-fold”. A questa famiglia appartengono, oltre alle tioredossine, anche le disolfuro-ossidoriduttasi bisolfuro (DsBs), le glutation-transferasi (GST), le perossiredossine (PRX), le glutation-perossidasi (GPXs) e le nucleoredossine (NRXs). Tutte queste proteine sono enzimi ubiquitari, conservati in tutti i regni viventi, dai virus agli eucarioti e prendono parte a una vasta gamma di processi biologici. Le glutaresossine sono state inizialmente descritte come partner della ribonucleotide reduttasi (Holmgren A., 1976), una proteina essenziale per la biosintesi di deossiribonucleotidi e in seguito è stato dimostrato che esse svolgono un ruolo nella riduzione di deidroascorbato ad ascorbato, nella riattivazione del legame al DNA per alcuni fattori di trascrizione. La GRX1 umana è inoltre fondamentale per la regolamentazione dell'attività di proteasi dell'HIV-1 in vitro. Ultimamente, un numero crescente di articoli pubblicati in letterarura ha messo in luce il ruolo di Grxs nell'omeostasi del ferro cellulare, dimostrandola loro abilità nel costruire, conservare e trasferire cluster ferro zolfo (ISC) di tipo [2Fe2S], suggerendo quindi che le Grxs sono probabilmente coinvolte nell'assemblaggio di metalloproteine e/o agiscono come sensori del ferro (Rouhier et al., 2010). Più in generale,le glutaredossine insieme al tripeptide glutatione (γ-glutamil-cisteinil-glicina) ee alla glutatione-reduttasi, sono note per mantenere lo stato redox intracellulare, proteggendo la cellula da specie reattive dell'ossigeno (ROS) e modulando la reattività di substrati contenenti cisteina, attraverso la formazione o la riduzione di legami disolfuro. Possono essere substrati di questa classe di enzimi sia i ponti disolfuro intramolecolari nelle proteine sia i legami intermolecolari formati dalle cisteine di una proteina con un tiolo a basso peso molecolare (disolfuri misti). Dal punto di vista strutturale, le Grxs sono generalmente piccole proteine globulari (9-14 kDa) caratterizzate da un motivo strutturale altamente conservato (thoredoxin-fold) che nel suo modello più semplice è costituito da un β-foglietto a 4 filamenti circondato da tre α-eliche. Una prima classificazione delle Grxs in sottoclassi è stata fatta sulla base della variabilità del sito attivo e del loro diverso comportamento biochimico (Herrero, E. et al, 2007.): le glutaredoxins classiche hanno in molti casi un sito attivo ditiolico CP(Y/F) C , i anche se sono stati riscontati casi con una sequenza non-canonica C(S/G)(Y/F)C, mentre una seconda classe distinta contiene un sito attivo monotiolico altamente conservato CGFS. Recentemente, l’analisi genomica comparativa ha portato ad un'ulteriore classificazione in sei classi, essendo le prime due classi più importanti (REF):la classe I raccoglie tutte le Grxs a singolo dominiocon sito attivo monotiolico e ditiolico di tipo CPY[C/S], CGYC, CPFC or CSY[C/S], la classe II contiene tutte le glutaredossine con sito attivo altamente conservato CGFS, sia a singolo dominio come proteine di fusione multidominio. È stato tuttavia suggerito che le Grxs a dominio singolo o multiplo dovrebbero essere messe in distinti gruppi funzionali (Hoffmann, BH et al., 2011). Le classi rimanenti sono limitati ad alcuni regni particulari (piante superiori, organismi fotosintetici eucarioti e cianobatteri, rispettivamente). In questo lavoro, la nostra attenzione è stata rivolta a due glutaredossine monotioliche di Trypanosoma brucei, Tb-Grx1 e Tb-Grx3. I tripanosomatidi sono protozoi parassiti del phylum Kinetoplastida e sono noti per essere gli agenti che causano alcune patologie diffuse in tutte le aree tropicali del Sudamerica (malattia di Chagas) e dell’Africa (in particolare la malattia del sonno umana ed una patologia bovina chiamata nagana). I tripanosomi codificano tre glutaredosine monotioliche: Grx1 e Grx2 sono localizzate nei cinetoplasti, i rudimentali mitocondri tipici di protozoi flagellati; la prima è una proteina omodimerica trovata ad una concentrazione fino a 5 M. Grx3 è invece l’unica glutaredossina monotiolica presente nel citosol di questi organismi ed ha la particolarità di essere una proteina di fusione costituita da due domini, in cui una glutatedossina C-terminale è unita mediante una sequenza di dieci residui non conservati ad una tioredoxina N-terminale (Filser, M. et al., 2008). Sia in Grx1 che in Grx3 i siti attivi divergono dal modello tipico conservato, sopra descritto per le glutaredossine monotioliche, il primo è caratterizzato infatti da una sequenza CAYS e il secondo dai residui CGFT. I ruoli biochimici di queste non sono ancora noti, anche se è è da segnalare l'assenza di attività per GRX1 nei comuni test di attività ossidoriduttasica, a differenza di Grx3 che è in grado di ridurre sia l'altro e ponti disolfuro intramolecolari, inoltre. Entrambe le proteine sono in grado di formare in vitro cluster ferro zolfo di tipo [2Fe2S]. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire delle informazioni sulle proprietà biochimiche e più in generale e più in generale sul loro ruolo nel metabolismo redox e sul metabolismo del ferro nei Tripanosomatidi attraverso lo studio mediante NMR della struttura e dinamica in soluzione di questi due enzimi. Inoltre, poiché è stato dimostrato che la Tb-Grx1 è fondamentale per la sopravvivenza del parassita (Manta, B. et al., comunicazione personale), le informazioni strutturali ottenute possono essere utili per sviluppo di nuovi farmaci destinati ii alle malattie menzionate in precedenza. Infine, per la loro peculiarità di essere rispettivamente un omodimero ed una proteina di fusione a due domini, gli studi strutturali su Tb-Grx1 e Tb-Grx3 possono essere utili per la classificazione delle glutaredossine sulla base della loro reattività, la loro terziario e, se presente, struttura quaternaria. Ad oggi (gennaio 2012), ci sono solo sei strutture identificate come glutaredossine monotioliche depositate nel Protein Data Bank, e tutte sono relative aproteine a proteine a singolo dominio e monomeriche. Per realizzare questi obiettivi, sono state messe a punto dellestrategie ottimali per tenere conto delle caratteristiche supramolecolare unica di Tb-GRX1 e Tb-Grx3. Dal momento che la determinazione della struttura di un omodimero in soluzione può essere molto complessa, una prima semplificazione, supportata da esperimenti biochimici (Manta et al, inedito) è consistita sullo studio della parte globulare della proteina Grx1, separata dal suo putativo dominio di dimerizzazione.La struttura della parte globulare di Grx1 è stata risolta con il metodo di classico sfruttando l’effetto nucleare Overhauser (NOE) per ottenere una serie didistanze tra coppie di atomi di idrogeno. Per fare ciò è stato necessario per ottenere la proteina isotopicamente marcata con 13C e 15N al fine di poter acquisire gli esperimenti NMR multidimensionali per realizzare l’assegnazione sequenziale delle frequenze di risonanza degli atomi in catena principale e nelle catele laterali. Per raggiungere questo scopo sono state utilizzate le tradizionali sequenze eteronucleari 3D implementate tuttavia in modalità TROSY (Pervushin, K., et al, 1997) e BEST (Lescop, E. et al., 2007) , per migliorare la risoluzione spettrale e la sensibilità, ma riducendo al minimo il tempo di acquisizione. Le risonanze delle catene laterali ed i vincoli di distanza NOE utilizzati dal software Cyana (Herrmann, T. et al., 2002a e 2002b) per il calcolo della struttura sono stati ottenuti rispettivamente mediante esperimenti 3D-TOCSY e 3D-NOESY. Il putativo dominio di dimerizzazione, composto di 28 aminoacidi, è stato invece ottenuto attraverso sintesi chimica e studiato preliminarmente tramite dicroismo circolare. Per verificare una sua possibile interazione con il dominio globulare di Grx1 sono stati eseguiti eseperimenti di tipo 2D HSQC sulla proteina marcata con 15N, assenza ed in presenza del peptide stesso. Tb-Grx3 al contrario consiste in una proteina di 24kDa composta da due domini, e per questo motivo risulta inadatta per una determinazione strutturale standard via NMR. : vincoli di distanza basati sull'effetto NOE dell'ordine dei 1-5A sono sia ostici da ottenere in un numero rilevante, a causa del fatto che all'aumentare delle dimensioni molecolari aumenta significativamente il numero dei segnali, sia inefficienti nel determinare la mutua orientazione tra i domini, ammesso che non vi siano dinamiche interne che coinvolgono le due parti. iii Per questa ragione abbiamo sviluppato un metodo per calcolare strutture ragionevoli a bassa risoluzione che sfruttano pochi vincoli sperimentali facili da acquisire, quali gli angoli diedri ricavabili dai chemical shifts del backbone e i residual dipolar couplings che danno informazione sulla mutua oorientazione di coppie di atomi, e ch eper questo motivo sono il metodo d'elezione per studi di questo genere. In particolare, la procedura completa è composta da un primo step in cui i due domini vengono ricavati per mezzo di homology modeling e successivamente soggetti a refinement con i dati sperimentali a disposizione (Chou et al., 2000) seguito da una fase di docking (Schwieters et al., 2010) guidato dagli RDC e dall'analisi della curva di Small Angle X-ray Scattering, in modo tale da garantire sia una corretta orientatazione che la compattezza della molecola