The role of mitotic slippage, USP1-regulated apoptosis, and multiple treatments in the action of temozolomide in glioblastoma multiforme

Background. Temozolomide (TMZ) is a methylating drug that is commonly used in the treatment of glioma. Although many features are still unclear, its general mechanism of action is well described. TMZ induces O6-methylguanine (O6MeG) lesions in DNA, which, in the absence of repair by O6-methylguanine methyltransferase (MGMT), mispair with thymine and start a futile cycle of repair-resynthesis events. The resultant DNA double-strand breaks (DSBs) activate the components of G2 checkpoint, and cells with a 4N DNA content accumulate and remain arrested at the G2/M boundary for several days. Cell death subsequently occurs by senescence, necrosis, or mitotic catastrophe, while apoptosis has been ruled out in many studies. Moreover, the effect of multiple TMZ treatments on G2 arrest and apoptosis induction is not clear. Repair of methylating drug-induced DNA lesions requires monoubiquitination of PCNA and FANCD2. Loss of either protein or inhibition of their monoubiquitination increases drug toxicity. USP1 is a hydrolase that removes monoubiquitin from PCNA and FANCD2, and can potentially play a role in TMZ mechanism of action. Materials and methods. U87, U251 (TMZ-sensitive, low MGMT), and GBM8 (TMZ-resistant, high MGMT) cell lines were used for experiments. The treatment was scheduled with 100μM TMZ for 3 hours for 1, 2, or 3 consecutive days. Cell cycle progression was studied with both FACS-based analysis and a novel time-lapse microscopic real-time analysis using FUCCI (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator), and apoptosis was measured with FACS-based Annexin V-PI analysis. To address the possible role of USP1 in TMZ action, we examined expression of USP1 at the mRNA levels in expression microarray databases derived from primary GBM. We also used siRNA targeting USP1 to modulate USP1 expression, and studied the effect of USP1 downregulation on TMZ-induced G2 arrest, cell death, and clonogenicity. Results. Compared to single treatment, multiple TMZ treatments cause a significant reduction of clonogenicity in TMZ-sensitive cells and induce a significant increase of apoptosis, particularly in a late stage. However, multiple treatments don’t have any major effect on cell cycle profile. Time-lapse microscopic analysis with FUCCI system showed that TMZ-sensitive glioma cells arrest at the G2 checkpoint for less than 48 hours and, in the presence of an activated G2 checkpoint, they replicate their DNA without cellular division, re-enter the cell cycle at the next G1 phase, and repeat the cycle, ultimately giving rise to polyploid cells. siRNA-mediated suppression of USP1 had no effect on cell cycle progression or the extent of temozolomide-induced G2 arrest. However, while USP1 knockdown alone had minimal effect on cell death, it increased temozolomide-induced loss of clonagenicity both in TMZ-sensitive and TMZ-resistant cells. Further examination of the mechanism of cell death suggested that while control cells, control cells exposed to TMZ, or USP1-suppressed cells rarely underwent apoptotic cell death, temozolomide-treated cells in which USP1 levels were suppressed underwent high rates of apoptosis. Conclusions. The present studies show that TMZ can induce apoptosis in TMZ-sensitive glioma cells, which is visible after 3 days but significant after 7 days. Multiple TMZ treatments don’t affect cell cycle profile, but significantly increase apoptosis. Moreover, time-lapse studies suggest a novel mechanism of action for TMZ, alternative to the one commonly accepted. These results have significant implications for the development of TMZ resistance. Furthermore, rather than sensitizing cells to DNA damaging agents, USP1 appears to suppress latent apoptotic pathways and to protect cells from temozolomide-induced apoptosis. These results identify a new function for USP1 and suggest that suppression of USP1 and/or USP1 controlled pathway may be a means to enhance the cytotoxic potential of temozolomide and to sensitize TMZ-resistant GBM cells

Introduzione. La temozolomide (TMZ) è un farmaco alchilante frequentemente utilizzato nella chemioterapia dei gliomi. Nonostante molti aspetti siano ancora enigmatici, il suo meccanismo di azione generale è ben noto. La TMZ induce metilazione della guanina nel DNA (O6MeG) che, in assenza di riparazione ad opera di O6-methylguanine methyltransferase (MGMT), si appaia con una timina innescando un ciclo futile di riparazione e risintesi. Ne risultano rotture del DNA a doppio filamento (DSBs) che attivano i componenti del checkpoint in G2, e le cellule con DNA 4N si accumulano e arrestano in G2 per parecchi giorni. Le cellule muoiono poi per senescenza, necrosi, o catastrofe mitotica, mentre l’apoptosi è stata a lungo negata. Inoltre non è chiaro l’effetto di somministrazioni multiple di TMZ sull’arresto in G2/M e sull’induzione di apoptosi. La riparazione delle lesioni al DNA causate dai farmaci alchilanti richiede la monoubiquitinazione di PCNA e FANCD2; la perdita di una delle due proteine o l’inibizione della loro monoubiquitinazione potenzia la tossicità indotta dagli agenti metilanti. USP1 è una idrolasi in grado di rimuovere la monoubiquitina da PCNA e FANCD2, e per questo può essere un regolatore della risposta alla TMZ. Materiali e metodi. Sono state utilizzate le linee cellulari U87, U251 (TMZ-sensibili, bassi livelli di MGMT) e GBM8 (TMZ-resistenti, alti livelli di MGMT). Il protocollo di trattamento prevede 1, 2 o 3 dosi di TMZ 100μM per 3 ore. La progressione nel ciclo cellulare è stata studiata sia con FACS sia con una nuova tecnica di microscopia time-lapse in tempo reale (FUCCI, Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator), mentre l’apoptosi è stata verificata al citofluorimetro con il metodo dell’annessina V-Propidio Ioduro. Per verificare il possibile ruolo di USP1 nell’azione della TMZ, dopo aver esaminato su databases di mRNA microarray l’espressione di USP1 nei glioblastomi, le cellule sono state transfettate con RNA a interferenza contro USP1 o di controllo. È quindi stato studiato l’effetto della soppressione dei livelli di USP1 sull’arresto in G2/M, la morte cellulare e la clonogenicità indotte dalla TMZ. Risultati. Trattamenti multipli con TMZ riducono la clonogenicità delle cellule di glioma sensibili al farmaco in maniera significativamente superiore rispetto al trattamento singolo, non modificano l’entità dell’arresto in G2, mentre inducono un significativo aumento dell’apoptosi in particolare in fase tardiva. L’analisi in time-lapse con il sistema FUCCI ha mostrato che le cellule sensibili alla TMZ subiscono un arresto in G2 inferiore alle 48 ore. Inoltre, in presenza di attivazione del checkpoint in G2, replicano il DNA ma non si dividono, rientrando nel ciclo cellulare in G1 e dando origine a cellule poliploidi. La soppressione dei livelli di USP1 da sola ha effetti minimi sulla progressione del ciclo cellulare e sulla morte cellulare sia nelle cellule sensibili che in quelle resistenti alla TMZ. Allo stesso modo, la soppressione dei livelli di USP1 non altera l’entità dell’arresto in G2/M indotto dalla TMZ. Tuttavia il knockdown di USP1 sorprendentemente incrementa la perdita di clonogenicità indotta dalla TMZ sia nelle cellule sensibili che in quelle resistenti. A differenza delle cellule di controllo in cui USP1 è stato soppresso, o di quelle con normale espressione di USP1 e trattate con TMZ, le cellule USP1-knockdown trattate con TMZ subiscono un’alta percentuale di morte per apoptosi. Conclusioni. I risultati dei nostri studi hanno mostrato che il trattamento delle cellule di glioma con TMZ può indurre apoptosi, e che questa è evidenziabile già dopo 3 giorni, sebbene diventi significativa solo tardivamente. Trattamenti multipli non modificano l’entità dell’arresto in G2, ma aumentano significativamente l’apoptosi. Inoltre gli studi di time-lapse permettono di proporre un nuovo meccanismo di azione per la TMZ, diverso da quello finora comunemente accettato, con significative implicazioni sullo sviluppo della resistenza al farmaco. La deubiquitinasi USP1, piuttosto che impedire l’attivazione di PCNA e FANCD2 e inibire in questo modo la riparazione del danno al DNA indotto dagli agenti metilanti, come indirettamente suggerito da studi precedenti, sembra invece sopprimere vie apoptotiche latenti e proteggere le cellule dall’apoptosi indotta dalla TMZ. La soppressione di USP1 o delle vie controllate da USP1 può rappresentare un modo per incrementare il potenziale citotossico della TMZ e per sensibilizzare GBM prima resistenti