Mechanism of atlastin-mediated membrane fusion and identification of atlastin functional partners involved in endoplasmic reticulum dynamics using Drosophila as a model.

Abstract The biogenesis and maintenance of the endoplasmic reticulum (ER) requires membrane fusion. ER homotypic fusion is driven by the large GTPase atlastin however the mechanisms governing atlastin-mediated membrane fusion are unknown. Using a structure-function analysis we investigated the mechanistic basis of nucleotide-dependent membrane fusion by Drosophila atlastin. Domain analysis of atlastin shows that a conserved region of the C-terminal cytoplasmic tail is absolutely required for fusion activity. Atlastin lacking the C-terminal domain are incapable of driving membrane fusion. When functional Drosophila atlastin is expressed, the normally reticular ER is lost and variably sized puncta are now stained with ER markers. However, overexpressing ER localized truncated atlastin essentially does not disrupt ER morphology demonstrating that it is a less or non-functional protein in vivo. Deletion analysis has allowed to establish that a middle domain folded as a 3 helix bundle (3HB) is important for oligomerization. Mutations disrupting the structure of the helices within the 3HB inactivate atlastin by preventing tethering and the subsequent fusion of ER membranes. Furthermore, increasing the distance of atlastin complex formation from the membrane inhibits fusion, suggesting that this distance is crucial for atlastin to promote fusion. Recently it has been shown that atlastin interacts with other ER tubule-forming proteins such as reticulon and REEP/Yop/DP1 families. We found that in Drosophila Dp1 and reticulon interact genetically with atlastin. The lethality associated with null atlastin mutations is largely suppressed by the simultaneous loss of reticulon function. Furthermore, the hyperfusion phenotype caused by atlastin overexpression in COS-7 cells is rescued by coexpression of Dp1 or reticulon. This result is supported by experiment in the fly eye. Expression of atlastin in the eye causes a small and rough eye phenotype. Overexpression of Dp1 in an eye simultaneously expressing atlastin resulted in the rescue of the atlastin-dependent phenotype. Instead, loss of reticulon exacerbates the rough eye phenotype caused by atlastin overexpression. These data show that atlastin exibits a strong, antagonistic interaction with both reticulon and Dp1 suggesting that these proteins are likely to exert opposing functions to regulate ER structure. We speculate that a balance between atlastin, reticulon, and Dp1 activities is important in maintaining and determining the morphology of the ER.

Riassunto La biogenesi e il mantenimento del Reticolo Endoplasmatico (ER) richiedono fusione delle membrane. La fusione omotipica delle membrane dell'ER dipende dalla GTPasi atlastina, tuttvia i meccanismi che governano il processo di fusione mediato da questa proteina sono ancora sconosciuti. Attraverso un’analisi struttura-funzione, abbiamo esaminato i meccanismi alla base del processo di fusione nucleotide-dipendente di atlastina nell’organismo modello Drosophila melanogaster. L'analisi dei domini di atlastina mostra che una regione conservata nella coda citoplasmatica C-terminale è indispensabile per la sua attività fusogena. Atlastina priva del dominio C-terminale non permette la fusione delle membrane. L’espressione di atlastina wild-type di Drosophila causa alterazione del caratteristico fenotipo reticolare dell'ER e marcatori del Reticolo evidenziano dilatazioni delle membrane reticolari di varie dimensioni. Al contrario, l'espressione di atlastina tronca della regione C-terminale non altera la morfologia del ER dimostrando che questa forma troncata è poco o non funzionale in vivo. L'espressione di atlastina tronca ha permesso di identificare un dominio intermedio costituito da un fascio di tre eliche che sono importanti per l'oligomerizzazione di atlastina. Mutazioni che distruggono la struttura delle alfa-eliche di questo dominio inattivano atlastina prevenendo l'avvicinamento e la conseguente fusione delle membrane del Reticolo Endoplasmatico. Inoltre, l’aumento della distanza di formazione del complesso di atlastina dalle membrane destinate a fondersi inibisce la fusione, suggerendo che questa distanza è cruciale per atlastina per promuovere la fusione. Recentemente è stato visto che atlastina interagisce con altre proteine coinvolte nel determinare la morfologia dell'ER appartenenti alle famiglie reticulon e REEP/Yop/DP1. I nostri studi hanno dimostrato che Dp1 e reticulon interagiscono funzionalmente con atlastina. La letalità dovuta a mutazione nulla di atlastina è recuperata dalla simultanea perdita di funzione di reticulon. Inoltre, l fenotipo di iperfusione causato da sovraespressione di atlastina in cellule COS-7 è recuperato co-esprimendo Dp1 o reticulon. Questo risultato è supportato da esperimenti nell'occhio di Drosophila. Espressione di atlastina wild type nell'occhio di Drosophila causa un occhio piccolo e rovinato. La sovraespressione simultanea di Dp1 e atlastina nell'occhio risulta nel recupero del fenotipo causato dall'espressione di atlastina. Al contrario, l'assenza di reticulon aumenta il fenotipo di occhio piccolo e rovinato dovuto a espressione di atlastina. Questi risultati mostrano una forte interazione genetica antagonistica tra atlastina e reticulon o Dp1, suggerendo che questa proteine esercitano funzioni opposte per regolare la struttura dell'ER. Ipotizziamo che un bilanciamento tra le attività di atlastina, reticulon e Dp1 sia importante nel mantenimento e nel determinare la morfologia del Reticolo Endoplasmatico.