Tamoxifen nel trattamento del carcinoma mammario: studio dei fattori predittivi di risposta

Breast cancer is the tumor with highest incidence in women and the first leading cause of mortality in Western countries. The estrogen receptor positive breast cancer subtype is the most frequent (60-80%) and for its treatment the selective estrogen receptor modulator tamoxifen can be used. Tamoxifen efficacy is widely recognized in the adjuvant setting (post-surgical) of early stages tumors, however, in a significant percentage of patients disease recurs. The aim of our study was to investigate possible factors contributing to the therapeutic failure of tamoxifen treatment in invasive non-metastatic estrogen receptor positive breast cancer patients. Tamoxifen is a pro-drug extensively metabolized by the hepatic cytochrome P450 CYP2D6 into more active and powerful metabolites compared to the parental drug. Among these it has been recently taken into special account the active metabolite endoxifen, which is considered the main responsible for the therapeutic response because of its high affinity for the molecular target, the estrogen receptor alpha (Erα) and because it shows higher plasma levels compared to the similarly active metabolite 4-idrossitamoxifen. Several studies have demonstrated that the gene of CYP2D6 enzyme is highly polymorphic in the population, due to variations in the gene sequence which result in functional alterations, with partial reduction or total elimination of the enzymatic activity. However, the inter-individual differences in endoxifen exposure, clinically observed, are not only explained by CYP2D6 gene polymorphisms, as its activity is significantly influenced also by environmental causes (such as drugs that inhibit the enzyme). Hence the need to identify new ways to predict individual ability of patients to activate tamoxifen, keeping endoxifen plasma levels as a reference parameter. The latter cannot be directly used to estimate the metabolic capacity of CYP2D6 when mostly needed, thas is before or in the early phases of drug treatment, because, due to the prolonged half-life of the drug and its derivatives, the achievement of steady state plasma levels (indicative of concentrations to which patients are exposed for five years of therapy) takes an average of four months. Finally, in addition to the exposure to the active metabolite, another predictive factor of response may include the molecular target of the drug, the estrogen receptor. It has been confirmed by numerous studies that in tumor and healthy mammary tissue estrogen receptor splicing isoforms of Erα and Erβ are coexpressed with the full-length proteins. Recently, an in vitro study revealed that the wild-type Erβ enhanced the antiestrogenic action of endoxifen. For the evaluation of the individual capacity in tamoxifen activation, to overcome genotyping limitations, two strategies were used: the phenotyping test of CYP2D6 by the probe drug dextromethorphan and the determination of endoxifen plasma levels at the first month (previous to the steady state). We have shown that the results of phenotyping test and levels of endoxifen at the first month are significantly associated with endoxifen steady state levels and both can be considered as informative tools to know the metabolic status of the individual patient. The influence of polymorphisms on endoxifen plasma levels was confirmed by genetic analysis of the CYP2D6 in our population; the genotyping results were also significantly associated with those of phenotyping test. The possible role of an estrogen receptor isoform, Erβ2, on the activity of endoxifen was evaluated, in vitro, by monitoring the transcription of two estrogens sensitive genes. Through analysis of expression of IL20 and ADORA1 it was found that, in the presence of concentrations of endoxifen of 40nM for prolonged time (24h), the isoform Erβ2, co-expressed with Erα, reduced the inhibitory action of endoxifen compared to the presence of only Erα.

La malattia tumorale maligna della mammella rappresenta ad oggi la neoplasia a più alta incidenza nel sesso femminile e la principale causa di mortalità nei paesi occidentali. Il tumore mammario positivo per gli estrogeni rappresenta il sottotipo più frequente (60-80%) per il cui trattamento è previsto l’impiego del modulatore estrogenico selettivo tamoxifen. Tamoxifen ha una efficacia largamente riconosciuta nella fase adiuvante (post-chirurgica) dei tumori in stadio iniziale, tuttavia in una percentuale rilevante di pazienti la malattia si ripresenta. Il nostro studio si pone l'obiettivo di indagare i possibili fattori implicati nel fallimento terapeutico del trattamento con tamoxifen nelle pazienti affette da tumore mammario infiltrante, positivo agli estrogeni, non metastatico. Tamoxifen è un pro-farmaco ampiamente metabolizzato dal citocromo epatico P450 CYP2D6 in metaboliti più attivi e potenti rispetto al farmaco parentale. Tra questi ha recentemente assunto particolare rilievo il metabolita attivo endoxifen, ritenuto il principale responsabile della risposta terapeutica poiché, oltre a possedere un'elevata affinità per il suo target molecolare, il recettore per gli estrogeni alpha (Erα), presenta livelli plasmatici più elevati in confronto al metabolita similmente attivo 4-idrossitamoxifen. Numerosi studi hanno dimostrato che il gene dell'enzima CYP2D6 è altamente polimorfico nella popolazione, a causa di variazioni nella sequenza genica che determinano alterazioni funzionali, con riduzione parziale o azzeramento della attività enzimatica. Tuttavia le differenze inter-individuali nella esposizione ad endoxifen, riscontrate clinicamente, non risultano essere spiegate unicamente dai polimorfismi del gene CYP2D6, poichè la sua attività risulta significativamente influenzata anche da cause cosiddette ambientali (ad esempio farmaci inibitori dell’enzima). Ne deriva la necessità di individuare altri strumenti per la determinazione della capacità delle singole pazienti di attivare il tamoxifen, mantenendo come parametro di riferimento i livelli plasmatici del metabolita attivo endoxifen. Quest’ultimo non può essere usato direttamente per predire la capacità metabolica del CYP2D6 quando maggiormente necessario, cioè prima o nelle prime fasi del trattamento farmacologico, perché, a causa dei prolungati tempi di emivita del farmaco e dei suoi derivati, il raggiungimento dei livelli plasmatici di stato stazionario (indicativi delle concentrazioni a cui sono esposte le pazienti per i cinque anni di terapia) richiede mediamente quattro mesi. Infine, oltre alla esposizione al metabolita attivo, un altro fattore predittivo di risposta potrebbe includere il bersaglio molecolare del farmaco, il recettore per gli estrogeni. Numerosi studi hanno confermato la co-espressione nei tessuti tumorali e sani mammari di isoforme di splicing alternativo alle due forme complete dei recettori estrogenici, Erα ed Erβ. Più recententemente, uno studio in vitro ha rivelato come la forma completa Erβ sia in grado di sensibilizzare le cellule all'azione di endoxifen. Per la valutazione della capacità individuale di attivazione del tamoxifen, superando i limiti della genotipizzazione, abbiamo utilizzato due modalità, il test di fenotipizzazone del CYP2D6 mediante il farmaco sonda destrometorfano e la determinazione dei livelli di endoxifen al primo mese, in fase pre-stazionaria, e li abbiamo correlati ai livelli di endoxifen allo stato stazionario. Abbiamo dimostrato che i risultati del test di fenotipizzazione e i livelli di endoxifen al primo mese sono molto significativamente associati ai livelli di esposizione al metabolita attivo endoxifen allo stato stazionario e possono essere considerati informativi dello status metabolico del singolo paziente. L'analisi genetica del CYP2D6 condotta sui soggetti arruolati ha confermato l'influenza dei polimorfismi sui livelli plasmatici di endoxifen; la genotipizzazione è anche significativamente associata al test di fenotipizzazione. Il possibile ruolo di una isoforma recettoriale estrogenica, Erβ2, sulla attività di endoxifen è stata valutata, in vitro, utilizzando l’induzione della trascrizione di due geni sensibili agli estrogeni. Mediante analisi dell'espressione di ADORA1 ed IL20 è emerso che, in presenza di concentrazioni di endoxifen di 40nM per intervalli di tempo prolungati (24h), l'isoforma Erβ2 co-espressa con Erα riduce l’azione inibitoria di endoxifen rispetto alla presenza di solo Erα.