A combined computational and experimental approach to human osteocalcin and GPCR Family C Group 6 Member A

INTRODUCTION. The use of mouse genetics recently highlighted coordination by endocrine regulation between bone, energy metabolism, and endogenous sex hormones. Osteocalcin, a bone matrix protein that regulates hydroxyapatite size and shape through its vitamin‑K-dependent γ‑carboxylated form, unraveled endocrinological functions in its circulating forms, that are not only simple markers of bone formation. Undercarboxylated osteocalcin administration regulates gene and protein expression in adipocytes, in pancreatic β cells, and in Leydig cells by a G protein-coupled receptor, GPRC6A receptor, with a potential gender selectivity. Total serum osteocalcin concentrations in humans are inversely associated with measures of glucose metabolism and cardiovascular risk factors; however, human data are inconclusive with regard to the role of uncarboxylated osteocalcin because most studies do not account for the influence of vitamin K or differentiate between the different γ‑carboxylated forms of osteocalcin. Intriguingly GPRC6A receptor mediates also the non-genomic effects of androgens and, although the information about SHBG-receptor structure is not conclusive, evidence seems to suggest that a G protein-coupled receptor is involved. AIM of the STUDY. Starting from clinical observations, we investigated the protein-protein interaction computational predictors of osteocalcin and SHBG with GPRC6A receptor, and we validated experimentally in vitro in a two-step approach. MATHERIAL and METHODS. Clinical and biochemical characteristics were studied in a cohort of 91 obese patients and healthy controls in a cross-sectional study. 3-D protein structure alignment analysis and protein docking analysis were resolved with a four (i.e. TM-align, FATCAT, TriangleMatch, TopMatch) and three (i.e. GRAMM-X, ZDOCK, PatchDock) different algorithms approach, respectively. ClickMD-min script was used as a molecular dynamic platform for computational analysis of the conformational structure of osteocalcin in presence or absence of Ca2+, developed with MOE software. Steered molecular dynamics simulations related to the carboxylation state were performed, and the data compared with the spectroscopic techniques results. Gene and protein expression analysis and cell-surface receptor binding assays (i.e. immunofluorescence and flow cytometry analysis) on HEK-293T cells experimentally validated the former results in vitro. RESULTS. Our study shows for the first time the existence of the competition for a specific binding site between osteocalcin and SHBG on human cells expressing GPRC6A receptor. The results are supported by a computational prediction analysis, describing amino acid residues of SHBG from Gly145 to Leu161 as a highly predicted interface. Our experiments describe the structure of human osteocalcin in its carboxylated and undercarboxylated forms for the first time. The influence of the binding of calcium on osteocalcin structure seems to be stronger than the presence of γ-carboxylated glutamic acid residues. Our clinical data show an imbalance between the γ‑carboxylated forms of osteocalcin in a cohort of hypogonadic obese an overweight patients, with decreased levels of SHBG and altered levels of the other sex hormones. CONCLUSIONS. The current two-step approach offers a target approach of investigation directly in humans, that has the potential to identify novel pathophysiological pathways as well as novel therapeutic possibilities. The computational basis of the possible binding of SHBG and osteocalcin has been experimentally validated and can directly lead to the synthesis of a peptide, whose physiological and therapeutic implications represent a feasible perspective for future research in an area of paramount importance, such as the cross-talk between bone, energy metabolism, and endogenous sex hormones.

INTRODUZIONE. L'uso di modelli murini transgenici ha permesso la recente identificazione di una regolazione reciproca tra osso, metabolismo energetico e ormoni sessuali. L’osteocalcina, una proteina della matrice ossea che subisce delle modifiche post-traduzionali vitamina-K dipendenti ed è classicamente implicata nella regolazione delle dimensioni e la forma dei cristalli di idrossiapatite, sembra essere nella sua forma circolante un ormone e non un semplice marcatore di rimaneggiamento osseo. La somministrazione di osteocalcina nella sua forma sottocarbossilata regola l’espressione genica e proteica negli adipociti, nelle cellule β pancreatiche e del Leydig attraverso un recettore associato a una proteina G, il recettore GPRC6A, con una selettività genere-specifica. Sono stati condotti numerosi studi che hanno associato i livelli di osteocalcina circolante sia con parametri di controllo gluco-metabolico che con fattori di rischio cardiovascolare. La gran parte degli studi clinici, tuttavia, non ha considerato né l'influenza dei livelli di vitamina K né ha rilevato l’osteocalcina nelle varie forme di differente carbossilazione. È interessante sottolineare, infine, come il recettore GPRC6A sia responsabile della mediazione degli effetti non-genomici degli androgeni e, analogamente, il recettore putativo dell’SHBG sembra essere un recettore associato a una proteina G. OBIETTIVO dello STUDIO. Obiettivo dello studio è stato studiare in un approccio in due fasi, supportati dalle osservazioni cliniche, le possibili interazioni tra l’osteocalcina, SHBG e il recettore GPRC6A a livello computazionale e, successivamente, verificarle in un modello sperimentale cellulare in vitro. MATERIALI e METODI. I parametri clinici e di laboratorio sono stati studiati in una coorte di 91 pazienti, che includevano pazienti obesi e soggetti sani di controllo con un disegno trasversale. Un’analisi della struttura proteica tridimensionale e una di docking sono state elaborate con rispettivamente quattro (i.e. TM-align, FATCAT, TriangleMatch, TopMatch) e tre (i.e. GRAMM-X, ZDOCK, PatchDock) algoritmi bioinformatici. La piattaforma iClickMD-min script é stata utilizzata per l’analisi computazionale della struttura conformazionale dell’osteocalcina, ottenuta tramite il software MOE, in diverse forme di carbossilazione e in presenza o assenza di ioni calcio. Tali analisi sono state integrate con simulazioni di dinamica molecolare, i cui risultati sono stati successivamente confrontati con quelli ottenuti dalle analisi spettroscopiche. I risultati sono stati validati con studi di espressione genica e proteica e saggi di spiazzamento con tecniche di immunofluorescenza e citofluorimetria su colture di cellule HEK-293T. RISULTATI. Il nostro studio dimostra per la prima volta l'esistenza di una competizione per un sito di legame specifico tra l’osteocalcina e SHBG su cellule umane che esprimono il recettore GPRC6A. Un’analisi predittiva computazionale supporta i risultati, identificando nella sequenza amminoacidica compresa tra i residui residui Gly145 e Leu161 di SHBG l’interfaccia più probabile. I nostri esperimenti descrivono, inoltre, per la prima volta la struttura dell’osteocalcina umana nelle sue varie forme di carbossilazione. L'influenza del legame degli ioni calcio sulla struttura dell’osteocalcina sembra, tuttavia, essere più forte della presenza di un differente stato di carbossilazione. I nostri dati clinici mostrano, infine, uno squilibrio tra le differenti forme di osteocalcina nella coorte di soggetti obesi affetti da ipogonadismo. CONCLUSIONI. L’approccio utilizzato nel presente studio offre un modello di indagine mirata sull’uomo con il potenziale di poter identificare nuove vie di regolazione e svelare prospettive terapeutiche. Il supporto bioinformatico all’interpretazione degli esperimenti in vitro offre i fondamenti per la sintesi del peptide precedentemente descritto, le cui implicazioni biologiche potranno essere preliminarmente validate sullo stesso modello, al fine di indagare le basi della regolazione integrata tra tessuto osseo, metabolismo energetico e ormoni sessuali.