Structural and functional characterization of sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPases (SERCA)

Ca2+ is the most versatile among the second messengers and is responsible for controlling several cellular processes. From cell growth and proliferation to programmed cell death, its versatility is employed to regulate processes as diverse as muscle contraction, secretion, energetic metabolism and synaptic plasticity. Therefore, the involvement of calcium in controlling several aspects of cell physiology demands the use of a sophisticated mechanism based on a wide set of protein components (toolkit), able to use oscillations in calcium concentration as a signal to regulate a variety of Ca2+-sensitive processes. Nonetheless, cells are unable to sustain prolonged increase of intracellular calcium. For this motif eukaryotic cells have evolved an efficient transport system (Ca2+ homeostasis) to maintain the intracellular concentration of calcium within a range 20-100 nM. As a response to a specific extracellular stimulus, a rapid increase of free Ca2+ (500-1000 nM) results in an immediate tissue specific cellular response, thanks to the ability of Ca2+- binding proteins to bind calcium by the EF-hand motif and activate several downstream effectors involved in other signaling pathway. The coordinated removal of cytosolic free Ca2+ out of the plasma membrane and into internal organelles (ER/SR) via the PMCA pump (plasma membrane Ca2+-ATPase) and the Na+/Ca2+exchanger, and via the SERCA pump (sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase) restores Ca2+ to its resting level. The most specialized mechanism of coordination of calcium signaling network can possibly be found in skeletal muscle, where the increase in cytosolic Ca2+ results in muscle contraction and removal of Ca2+ induces muscle relaxation. Since in human about 70% of cytosolic Ca2+ returns to the sarcoplasmic reticulum (SR) and since it represents the major source of Ca2+ store, the SERCA pump is consequently involved in regulating the excitation-contraction coupled mechanism in skeletal and cardiac muscle. The SERCA protein shares the catalytic properties of ion-motive ATPases of the P-type family, characterized by the formation of an energized intermediate, resulting from the auto-phosphorylation of a key invariant aspartate residue in a highly conserved sequence. Basically, the P-type family members couple the active transport of ions across the membrane to the hydrolysis of ATP through a reaction cycle proposed more than 30 years ago, called Post-Albers cycle. With respect to other members of P-type family, the SERCA pump differs in tissue distribution, regulation, transport specificities and role in Ca2+ homeostasis. It is encoded by a family of three genes, SERCA 1, 2, 3 and its isoforms diversity is highly increased by alternative splicing of the transcripts, principally at the COOH-terminal. At present, more than 10 different SERCA isoforms have been detected at the protein level, but only the 3D structure of isoform 1a from rabbit has been determined. The first X-ray crystal structure of SERCA solved by the group of Toyoshima about 13 years ago represents a milestone in the understanding of the molecular machine responsible for calcium pumping. It has established the basement for the building of all the following knowledge about the P-type ATPase family. Since then, crystallographers have worked very hard trying to elucidate the P-type pump catalytic cycle. In particular, two research groups (the groups of C. Toyoshima in Japan and P. Nissen in Denmark) have moved their efforts towards the understanding of the ATP-driven ion transport mechanism, producing and analyzing at atomic resolution (2,3-3 Å) the 3D crystals of several intermediates of SERCA1a. Their studies have opened the way to the recent advances in membrane proteins crystallography. In fact, about 44 crystal structures of rabbit SERCA1a, possibly mimicking all the conformational states of the enzyme cycle, have been so far deposited in the Protein Data Bank (PDB) and the three-dimensional structure of SERCA1a from rabbit skeletal muscle continues to be considered the archetype of the P-type ATPases family. Since SERCA pumps play a key role in the regulation of calcium homeostasis, alteration of their activity has been investigated in relation to two human diseases associated with SERCA pump gene defects: the Brody’s and Darier’s disease. The former is a rare recessive muscular condition characterized by an exercise-induced impairment of muscle relaxation. The underlying cause for muscle contracture has been found to be associated to a SERCA reduced activity, resulting from a defect in the gene coding for SERCA1a isoform (ATP2A1). Nonetheless, the origin of the SERCA deficiency is still controversial. The second genetic pathology known as Darier’s disease is a rare autosomal dominant skin disorder characterized by loss of cell-to-cell adhesion and abnormal keratinization of the epidermis. More than 130 mutations in the gene coding for the SERCA2 isoforms (ATP2A2) have been identified in human patients. Differently from Brody’s disease, the clinical symptoms are restricted to the epidermis and specific area of the skin and it is thought that this localization reflects genetic mosaicism. Our structural contribution to the understanding of the effects of point mutations on the protein conformation come from the crystal structure of bovine SERCA pump, recently solved at 2.9 Å resolution. Since an R164H substitution has been identified in cows affected by congenital pseudomiotonia and a Hungarian patient affected by Brody’s disease was found to carry the same mutation, this animal could be used as a suitable model for studying human pathology. In addition, this protein represents the first crystal structure of SERCA1a from a source different from rabbit. The protein was extracted from a portion of Cutaneus trunci muscle and homogenized and solubilized with deoxycholate or C12E8 detergent. Crystals were obtained by using the hanging drop vapor diffusion technique and the structure solved by molecular replacement. X-ray data collection was performed at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble, France. The crystallographic R factor of the refined final structure is 0.23. The overall molecular model is very similar to that of the rabbit enzyme, as expected by the high amino acid sequence identity. Nevertheless, the bovine enzyme has reduced catalytic activity with respect to the rabbit enzyme. Subtle structural modifications, in particular in the region of the long loop that protrudes into the SR lumen connecting transmembrane α-helices M7 and M8, explain the difference. About the pathological mutant, since the mutation is located in the A domain of the pump, which is involved in large movements of the pump during its reaction cycle, it is possible to speculate about the effect of the mutation on the protein conformation, on the basis of our structure. In the E1.AMPPCP state, the negatively charged Glu2 counterbalances the protonated side chain of Arg164 that acts as a central 'anchor point' for three different stretches of the A-domain fold. The substitution of the side chain of the arginine with the imidazole of the His residue could destabilize the conformation of the pump during the E1-E2 transition, probably enhancing the sensibility of the protein to proteolytic degradation. Since the aim of my PhD project is the study of the SERCA pump gene defects responsible for human genetic disease, the SERCA 2a isoform represents another important target for our structural investigations. This protein is the major player involved in the regulation of the excitation-contraction coupling of the heart. Evidences from human and experimental models of heart failure have demonstrated that alterations in SR calcium handling are associated with an impaired contractility. Other evidences also seem to suggest that mutations of the isoform 2a may predispose to cardiac diseases. Recently, SERCA2a pump gene transfer was demonstrated to be safe and effective in restoring contractile function via over-expression of SERCA2a under physiological and patho-physiological conditions. The determination of the crystal structure of the SERCA2a could help to elucidate the molecular mechanisms responsible for Ca2+ signaling dysfunction as well as to design and study specific inhibitors of the heart SERCA2a enzyme. In our work, the human SERCA2a was expressed in Saccharomyces cerevisiae as a recombinant protein with a biotin acceptor domain (BAD) linked to the C-terminus (hSERCA2a-BAD) by a thrombin cleavage site. Owing to the presence of a thrombin cleavage site within the protein sequence, a point mutant (R863G) was generated and the protein was successfully expressed. In vivo yeast biotinylation of BAD added as a tag to SERCA2a has offered both a fast and efficient affinity purification strategy and a positive selection of the properly folded enzyme. To obtain sufficient amount of protein to perform crystallization trials, a protocol for batch fermentation of S. cerevisiae was optimized in a home made bioreactor. The protein was solubilized with a buffer containing n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) at the appropriate CMC. Finally, the enzyme was purified by avidin-affinity strategy, using two different purification tools (the avidin resin and the avidin magnetic nanoparticles). Finally, a new protein target has been the object of structural investigations: the EFhd2 calcium-binding protein. This protein represents a novel tau-associated protein identified in the JNPL3 tauopathy mouse model, which develops neurodegeneration in age-dependent manner. This evidence has been also validated in human affected by Alzheimer’s disease, where the association between tau and the novel calcium-binding protein was found enhanced. The tau protein plays a key role in the appearance of tauophathies, which are described as a group of neurological disorders characterized by the aggregation of hyperphosphorylated and filamentous tau proteins organized in neurofibrillary tangles. Despite the tau phosphorylation process has been intensely studied, the molecular mechanism underlying the tau-mediated neurodegeneration is poorly understood. The identification of the new tau-associated protein EFhd2 and its structural characterization could help to elucidate the mechanisms responsible for tauopathies. In our work, the recombinant EFHD2 protein was expressed in Escherichia coli as a poly-histidine-tagged fusion protein. The protein has been purified, concentrated and used for crystallization trials. Despite diffracting crystals have not been obtained yet, preliminary tests appear quite promising

Il Ca2+ è il più versatile tra i secondi messaggeri ed è responsabile del controllo di numerosi processi cellulari. Dalla crescita e proliferazione cellulare alla morte programmata, la sua versatilità è impiegata per regolare diverse tipologie di processi quali la contrazione muscolare, la secrezione, il metabolismo energetico e la plasticità sinaptica. Il coinvolgimento del calcio nel controllo di diversi aspetti della fisiologia cellulare richiede, pertanto, l’utilizzo di un sofisticato meccanismo basato su un set di componenti proteici (toolkit), in grado di usare le oscillazioni nella concentrazione del calcio come segnale per regolare una varietà di processi Ca2+ sensibili (Ca2+ sensitive processes). Tuttavia, le cellule non sono in grado di sostenere incrementi prolungati di calcio intracellulare. Per questo motivo le cellule eucariote hanno evoluto un efficiente sistema di trasporto (Ca2+ homeostasis) per mantenere la concentrazione intracellulare di calcio entro un intervallo tra i 20-100 nM. In risposta ad uno stimolo extracellulare, un rapido incremento del Ca2+ libero (500-1000 nM) produce un’immediata risposta cellulare tessuto-specifica, grazie all’abilità delle proteine che legano il calcio (Ca2+ sensitive proteins) di attivare diverse proteine bersaglio coinvolte in altre vie di segnalazione, in seguito al loro legame attraverso il motivo strutturale a mani EF. La coordinata rimozione del Ca2+ citosolico fuori dalla membrana plasmatica e dentro gli organelli interni (ER/SR) attraverso la pompa PMCA (Ca2+-ATPase della membrana plasmatica) e lo scambiatore Na+/Ca2+ e attraverso la pompa SERCA (Ca2+-ATPase del reticolo sarcoendoplasmatico) ripristina il livello basale del Ca2+. Il più specializzato meccanismo di coordinazione della rete di segnalazione del calcio può essere probabilmente trovato nel muscolo scheletrico, dove un aumento della concentrazione del Ca2+ produce la contrazione muscolare mentre la sua rimozione induce il rilassamento muscolare. Poiché negli umani circa il 70% del Ca2+ citosolico ritorna nel reticolo sarcoplasmatico (SR) e poiché quest’ultimo rappresenta la maggiore riserva di Ca2+, la pompa SERCA è conseguentemente coinvolta nella regolazione del meccanismo accoppiato di contrazione e rilassamento nel muscolo scheletrico e cardiaco. La proteina SERCA condivide le proprietà catalitiche del motivo ionico della famiglia delle P-type ATPasi, caratterizzata dalla formazione di un intermedio fosforilato, derivante dall’autofosforilazione di un residuo di aspartato nella loro sequenza altamente conservata. In sintesi, i membri della famiglia P-Type accoppiano il trasporto attivo di ioni attraverso la membrana all’idrolisi dell’ATP tramite un ciclo di reazione proposto 30 anni fa, chiamato Post-Albers cycle. Rispetto agli altri membri, la pompa SERCA si differenzia per la sua distribuzione tissutale, la regolazione, la specificità e il ruolo nell’omeostasi del calcio. Essa è codificata da una famiglia di tre geni, SERCA 1, 2, 3 e la variabilità delle sue isoforme è legata ad uno splicing alternativo del trascritto primario, specialmente al COOH-terminale. Finora, più di 10 isoforme sono state identificate a livello proteico, ma solo la struttura tridimensionale dell’isoforma1a di coniglio è stata determinata. La prima struttura cristallografica della SERCA, risolta dal gruppo di Toyoshima circa 13 anni fa, rappresenta una pietra miliare nella comprensione della macchina molecolare responsabile del trasporto attivo del calcio. Essa ha stabilito le basi per la costruzione di tutte le attuali conoscenze relative alla famiglia delle P-type ATP-asi. Da allora, i cristallografi hanno lavorato faticosamente nel cercare di chiarire il ciclo catalitico della pompa P-type. In particolare, due gruppi di ricerca (il gruppo di C. Toyoshima in Giappone e quello di Nissen in Danimarca) hanno mosso i loro sforzi verso la comprensione del meccanismo di trasporto ionico attivato dall’ATP, producendo e analizzando a livello atomico (2,3-3 A) le strutture cristallografiche di diversi intermedi della SERCA1a. I loro studi hanno aperto la strada ai recenti progressi nella cristallografia delle proteine di membrana. Infatti, circa 44 strutture della SERCA1a di coniglio, che cercano di simulare tutti gli stati conformazionali del ciclo enzimatico, sono state depositate nella Banca Dati Proteica (PDB) e la struttura tridimensionale della SERCA1a dal muscolo scheletrico continua ad essere considerata l’archetipo della famiglia della P-type ATPasi. Poiché le pompe SERCA svolgono un ruolo chiave nella regolazione dell’omeostasi del calcio, variazioni nella loro attività proteica sono state identificate in due malattie umane associate a difetti nei geni codificanti per la pompa SERCA: la malattie di Brody e di Darier. La prima è una rara e recessiva condizione muscolare caratterizzata da una riduzione nel rilassamento muscolare indotta dall’esercizio. La causa della contrattura è associata ad una riduzione nell’attività della SERCA, derivante da un difetto nel gene codificante l’isoforma 1a (ATP2A1). Tuttavia, l’origine di questa riduzione è ancora controversa. La seconda patologia genetica, nota come malattia di Darier, è un raro disturbo autosomico dominante della pelle, caratterizzato da un’assenza di adesione tra le cellule e un’anomala cheratinizzazione dell’epidermide. Sono state identificate più di 130 mutazioni nel gene codificante per le isoforme 2a (ATP2A2) in pazienti umani. A differenza della malattia di Brody, i sintomi clinici, ristretti all’epidermide e a specifiche aree della pelle, probabilmente riflettono un mosaicismo di tipo genetico. Il nostro contributo strutturale alla comprensione degli effetti delle mutazioni puntiformi sulla conformazione proteica deriva dalla struttura cristallografica della pompa SERCA1a bovina, recentemente risolta a 2.9 Å di risoluzione. Poiché una mutazione da arginina a istidina nella posizione 164 è stata identificata in una mucca affetta da pseudo miotonia congenita e la stessa mutazione è stata identificata in un paziente ungherese affetto dalla malattia di Brody, questo animale potrebbe essere usato come modello compatibile allo studio delle patologie umane. Inoltre, questa struttura rappresenta la prima struttura cristallografica da una fonte diversa da quella di coniglio. La proteina è stata estratta da una porzione del muscolo Cutaneus trunci, che è stato omogeneizzato e solubilizzato con i detergenti deossicolato e C12E8. I cristalli proteici sono stati ottenuti tramite la tecnica dell’hanging drop con il metodo della diffusione di vapore e la struttura è stata risolta con il metodo della sostituzione molecolare. La raccolta dei dati cristallografici è stata eseguita nella struttura del sincrotrone europeo (ESRF) a Grenoble, Francia. Il fattore cristallografico R del modello strutturale raffinato è 0.23. Nel complesso il modello è simile a quello dell’enzima di coniglio, come atteso dall’alta identità della sequenza amminoacidica. Tuttavia, l’enzima bovino mostra una ridotta attività catalitica rispetto a quella del coniglio. Qualche piccola modificazione, in particolare nella regione del loop che protrude nel lume del reticolo sarcoplasmatico e che connette le α-eliche M7 e M8, potrebbe spiegare la differenza. Riguardo alle forme patologiche, poiché la mutazione è localizzata nel dominio A della pompa, cruciale nel ciclo di reazione, sulla base della nostra struttura è stato possibile fare delle speculazioni sugli effetti che la mutazione potrebbe produrre sulla conformazione proteica. Nello stato E1- AMMPPCP, il residuo di acido glutammico carico negativamente controbilancia la catena laterale protonata dell’Arg164 che agisce come perno centrale per tre differenti stiramenti del dominio A. La sostituzione della catena laterale dell’arginina con l’imidazolo del residuo d’istidina potrebbe destabilizzare la conformazione della pompa durante la transizione tra gli stadi E1-E2, aumentando probabilmente la suscettibilità della proteina alla degradazione proteolitica. Poiché lo scopo del mio progetto di dottorato è lo studio dei difetti genici responsabili delle malattie umane, l’isoforma SERCA2a rappresenta un altro importante bersaglio dei nostri studi strutturali. Questa proteina svolge un ruolo chiave nella regolazione del meccanismo accoppiato di contrazione e rilassamento del muscolo cardiaco. Risultati ottenuti da pazienti colpiti da infarto cardiaco e da modelli sperimentali hanno dimostrato che alterazioni nella regolazione del flusso di calcio sono associate a una ridotta contrattilità. Altre evidenze sembrano, inoltre, suggerire che alcune mutazioni nell’isoforma2a possono predisporre a malattie cardiache. Recentemente, la terapia di trasferimento genico della SERCA2a si è dimostrata sicura ed efficace nel ripristinare la funzione contrattile del cuore, attraverso l’over espressione della SERCA2a in condizioni fisiologiche e pato-fisiologiche. La determinazione della struttura cristallografica della SERCA2a potrebbe quindi aiutare a chiarire i meccanismi molecolari responsabili della disfunzione nel processo di segnalazione del calcio, così come aprire la possibilità di identificare e studiare gli inibitori proteici specifici per la SERCA2a. Nel nostro lavoro, l’isoforma2a umana è stata espressa in Saccharomyces cerevisiae come proteina ricombinante con un dominio accettore di biotina (BAD) legato al C-terminale (hSERCA2a-BAD) da un sito di taglio per la trombina. Poiché quest’ultimo era presente anche dentro la sequenza proteica, una mutazione puntiforme (R863G) è stata generata e la proteina è stata espressa con successo. In vivo, la biotinilazione del BAD aggiunto come sito “bersaglio” alla SERCA2a ha offerto sia una veloce ed efficiente strategia di purificazione che una selezione positiva dell’enzima propriamente foldato. Per ottenere una sufficiente quantità di enzima purificato in modo da realizzare prove di cristallizazione, in un reattore costruito in laboratorio, è stato ottimizzato un protocollo per la fermentazione in batch in S. cerevisiae. La proteina è stata quindi solubilizzata in un tampone con DDM alla appropriata concentrazione critica micellare. Alla fine, l’enzima è stato purificato attraverso la purificazione per affinità all’avidina, usando due differenti sistemi di purificazione (avidina coniugata alla resina e nano particelle rivestite di avidina). Per finire, un nuovo target è stato oggetto dei nostri studi strutturali: la proteina che lega il calcio EFHD2. Questa rappresenta una nuova proteina associata alla tau che è stata identificata nel modello sperimentale di topo (JNPL3), specifico per lo studio delle tauopatie. Il modello sperimentale sviluppa infatti neuro degenerazione in maniera dipendente dagli anni. Questa evidenza è stata anche riscontrata in pazienti affetti da Alzheimer, nei quali è risultata più elevata l’associazione tra la tau e la EFHD2. La proteina tau svolge un ruolo chiave nella comparsa delle tauopatie, che sono descritte come un gruppo di malattie neurologiche caratterizzate dall’aggregazione di proteine tau iperfosforilate e filamentose, organizzate in gomitoli di neurofibrille. Nonostante il processo di fosforilazione sia stato studiato intensivamente, il meccanismo molecolare alla base della neuro degenerazione mediato dalla tau è ancora poco studiato. L’identificazione della nuova proteina EFhd2 associata alla tau e la sua caratterizzazione strutturale potrebbero aiutare a chiarire i meccanismi responsabili delle tauopatie. Nel nostro lavoro, la proteina ricombinante EFhd2 umana è stata espressa in E. coli come proteina di fusione con un tag di istidine. La proteina è stata purificata, concentrata e usata per le prove di cristallizazione. Nonostante non siano ancora stati ottenuti cristalli diffrangenti, le prove preliminari appaiono veramente promettenti