Unraveling the mechanisms of alpha-synuclein aggregation and toxicity

Parkinson’s disease is the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer’s disease and affects about 1% of the population over 65 years old. This disorder can be both sporadic and familial and some genetic forms are due to mutations in SNCA gene, encoding for the protein alpha-synuclein (aS). PD pathological hallmarks are the prominent death of the dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta and the presence of proteins and lipid inclusions, termed Lewy’s body (LBs), in the surviving neurons in parkinsonian brains. The main constituent of LBs is an aggregated fibrillar beta-sheet rich form of aS. aS aggregation process was widely studied in the past years: the protein is unfolded in its native state, but in pathological conditions it tends to aggregate forming oligomeric species. These oligomers constitute a heterogeneous and transient ensemble and rapidly convert into amyloid fibrils when they reach a critical concentration. Amyloid fibrils then deposit in LBs along with several other proteins and lipids. aS aggregation was mainly studied in vitro, but recently more efforts were put into the study of this process in cell and animal models, to identify not only aS aggregation intermediates, but also the associated toxic mechanism(s) that lead to neurons cell death in PD. In this thesis two main issues were faced: the study of aS aggregation in cells using unconventional methods and the characterization of the effects of the family of chaperone-like proteins 14-3-3, on aS aggregation. In the first part, two cellular models for the study of aS aggregation were set and characterized: the first one is obtained just overexpressing aS and allowed the characterization of an ensemble of heterogeneous oligomeric species (about 6±4 monomers per oligomer) using a new fluorescence microscopy method termed Number and Brightness analysis. These oligomeric species induced autophagic lysosomal pathway activation and mitochondrial fragmentation in this model. The second cellular model provides a method to study aS fibrils and larger aggregates in a physiological environment: aS was overexpressed in cells and aggregation was triggered by introducing in cell cytoplasm recombinant aS fibrils fragments, termed seeds. In both cases aS overexpression and aggregation cause cellular death, in good agreement with what was previously published by others groups. The characterization of aS aggregation in cells went further looking at the variation in cellular metabolism, possibly induced by mitochondrial damage. These changes were quantified measuring NADH fluorescence properties in the two models with respect to the control. These results showed that in cells presenting aS oligomer or aggregates, NADH fluorescence lifetime and emission spectra change, suggesting that these measurements may be used to detect aS aggregates in live cells and in vivo using a non-invasive dye-free method. The second part of the thesis concerns the ability of 14-3-3 chaperone-like proteins of interacting with aS and of interfering with aS aggregation process rescuing the induced toxicity in cells. Among the seven 14-3-3 isoforms, 14-3-3 eta can re-route aS amyloidogenic process in vitro, leading to the formation of curved objects rather than aS fibrils. These curved objects have diameters and curvatures that depend on 14-3-3 eta amount in the aggregation assays; moreover, 14-3-3 eta molecules were found in these aggregates, suggesting the formation of a stable complex between the two proteins. When aS amount is too large or seeds are used to trigger the aggregation process in vitro, 14-3-3 eta is not able any more to affect aS aggregation and is sequestered into aS fibrils. In cell models, 14-3-3 eta overexpression leads to a rescue when aS was only overexpressed, but not when aggregation in cell cytoplasm was triggered by seeds. Overexpressed 14-3-3 eta was found to interact with overexpressed aS using image correlation spectroscopy methods (cross raster image correlation spectroscopy and cross Number and Brightness analysis), mainly at plasma membrane. Moreover, 14-3-3 eta is sequestered into aggregates when aS aggregation is triggered by seeds, highlighting another possible toxic mechanism due to aS aggregation. All the results obtained in cells are in good agreement with the in vitro results previously reported, further suggesting that 14-3-3 proteins and eta isoform in particular are interesting in aS aggregation frame and may be used to interfere in the process to rescue its toxic effects.

La malattina di Parkinson è la seconda malattia neurodegenerative più comune dopo il morbo di Alzheimer e colpisce circa l’1% delle popolazione sopra i 65 anni di età. Questa malattia può essere sia sporadica che familiare e alcune forme genetiche sono dovute a mutazioni nel gene SNCA che codifica per la proteina alfa-sinucleina. Le caratteristiche patologiche principali della malattia di Parkinson sono la morte prevalentemente dei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta e la presentza di inclusioni proteiche e lipidiche, dette corpi di Lewy, nei neuroni che sopravvivono nei cervelli dei pazienti affetti dalla malattia. Il componente principale dei corpi di Lewy è una forma di alfa-sinucleina aggregata, fibrillare e ricca di foglietti beta. Il processo di aggregazione di alfa-sinucleina è stato ampiamente studiato negli anni passati: la proteina è non strutturata nella sua forma nativa, ma in condizioni patologiche tende ad aggregare formando specie oligomeriche. Questi oligomeri costituiscono un insieme etereogeneo e transiente e si convertono rapidamente in fibrille amiloidi quando raggiungono una concentrazione critica. Le fibrille amiloidi di alfa-sinucleina si depositano poi nei corpi di Lewy assieme ad altre proteine e lipidi. L’aggregazione di alfa-sinucleina è stata principalmente studiata in vitro, anche se più recentemente maggiori sforzi sono stati effettuati per caratterizzare il processo in modelli cellulari ed animali, per identificare non soltanto i diversi prodotti dell’aggregazione, ma anche i meccanismi tossici ad essi associati, che causano la morte dei neuroni nei pazienti affetti dalla malattia di Parkinson. In questa tesi due questioni principali sono state affrontate: lo studio dell’aggregazione di alfa-sinucleina in cellule utilizzando metodi non convenzionali di microscopia in fluorescenza e la caratterizzazione degli effetti di una famiglia di proteine chaperoniche, le 14-3-3, sul processo di aggregazione. Nella prima parte, due modelli cellulari per lo studio dell’aggregazione di alfa-sinucleina sono stati approntati e caratterizzati: il primo viene ottenuto sovraesprimento soltanto alfa-sinucleina e ha permesso la caratterizzazione di un ensemble di oligomeri eterogenei in cellule vive (circa 6±4 monomeri per oligomero) utilizzando un nuovo metodo di microscopia in fluorescenza chiamato Number and Brightness analysis. Queste specie oligomeriche inducono l’attivazione del sistema autofagico-lisosomiale e la frammentazione dei mitocondri in questo modello cellulare. Il secondo modello cellulare fornisce un metodo per lo studio delle fibrille di alfa-sinucleina e di aggregati più grandi in un ambiente di rilevanza fisiologica: alfa-sinucleina è stata sovrespressa in cellule e l’aggregazione è stata promossa introducendo nel citoplasma delle cellule frammenti di fibrille ottenute da alfa-sinucleina ricombinante, detti seeds. In entrambi i casi la sovraespressione e l’aggregazione di alfa-sinucleina hanno causato morte cellulare, in buon accordo con quello che è stato riportato in precedenza da altri gruppi di ricerca. La caratterizzazione dell’aggregazione di alfa-sinucleina in cellule è continuata osservando la variazione nel metabolismo cellulare, potenzialmente indotta da danni ai mitocondri. Queste variazione sono state quantificate misurando le proprietà della fluorescenza del NADH nei due modelli, rispetto al controllo. Questi risultati hanno mostrato che in cellule che presentano oligomeri o aggregati di alfa-sinucleina, il tempo di vita della fluorescenza del NADH e il suo spettro di emissione cambiano. Quindi, queste misure potrebbero essere ottimizzare per rilevare la presenza di aggregati di alfa-sinucleina in cellule e in vivo, utilizzando un metodo di indagine non invasivo e dye-free. La seconda parte della tesi riguarda l’abilità delle proteine chaperoniche 14-3-3 di interagire con alfa-sinucleina e di interferire con il suo processo di aggregazione, riducendone la tossicità in cellule. Tra le sette isoforme della famiglia di 14-3-3, la 14-3-3 eta può revertire il processo di fibrillazione di alfa-sinucleina in vitro, portando alla formazione di oggetti curvi invece che di fibrille canoniche. Questi oggetti curvi hanno diametri e curvature che dipendono dalla quantità di 14-3-3 eta nel saggio di aggregazione: inoltre, molecole di 14-3-3 eta sono state trovate in questi aggregati, suggerendo la formazione di un complesso stabile costituito dalle due proteine. Quanto la quantità di alfa-sinucleina è troppo grande o i seeds vengono utilizzati per promuovere il processo di aggregazione in vitro, la 14-3-3 eta non è più in grado di interferire con il processo di aggregazione di alfa-sinucleina e viene sequestrata nelle fibrille. Nei modelli cellulari, la sovraespressione di 14-3-3 eta riduce la tossicità indotta da alfa-sinucleina quando quest’ultima è soltato sovraespressa e oligomerizza, ma non quando l’aggregazione in cellule viene promossa dai seeds. È stato mostrato, utilizzando tecniche di image correlation spectroscopy (cross raster image correlation spectroscopy e cross Number and Brightness analysis) che la 14-3-3 eta sovraespressa può interagire con alfa-sinucleina sovraespressa, principalmente alla membrana plasmatica. Inoltre, la 14-3-3 eta viene sequestrata negli aggregati quando il processo di aggregazione di alfa-sinucleina è indotto dai seeds, evidenziando un altro possibile meccanismo di tossicità dovuto all’aggregazione. Tutti i risultati ottenuti in cellule sono in buon accordo con i risultati ottenuti in vitro e precedentemente riportati; questo rafforza ulteriormente l’idea che le proteine 14-3-3 e in particolare l’isoforma eta siano particolarmente interessanti nel contesto dello studio dell’aggregazione di alfa-sinucleina e che potrebbero essere utilizzare per interferire con il processo di aggregazione e ridurne gli effetti tossici.