Gene and microRNA expression predictive of tumour response in patients treated with preoperative chemoradiotherapy for rectal cancer

Background Preoperative chemoradiotherapy (pCRT) followed by surgery is the standard treatment for locally advanced rectal cancer (LARC). However, the response to pCRT is not uniform, and there is no effective method to predict tumour response to pCRT. Identification of patients not responsive to pCRT could avoid useless exposure to radiation or chemotherapy which is associated with adverse effects. Moreover, the identification of pathological complete response could select patients candidated to a more preserving surgery. The aim of this study is to investigate whether gene and micro-RNA (miRNA) expression profiling is associated with rectal cancer response to pCRT. Materials and methods Tissue biopsies were obtained from patients with mid-low LARC, before pCRT. All the patients underwent standard pCRT followed by resection. All surgical specimens underwent standardized histopathological examination. The biopsies with ≥50% of cancer tissue were considered for the experiment. Gene and miRNA expression was analyzed using one color microarrays technique (Agilent®), after RNA isolation. The data were normalized intra- and inter-array, filtered and then clustered. Gene and miRNA expression was compared between responders (R) and non responders (NR) as measured by histopathological tumour regression grade (TRG). Validation of microarrays data was made by quantitative PCR (qPCR). Results Thirty-eight patients, 16 (42%) R (TRG1-2) and 22 (58%) NR (TRG3-5), were considered. Using SAM (Significance Analysis of Microarrays) two class, 256 genes were found differentially expressed between NR and R (188 over- and 68 down-expressed). Performing PAM (Prediction Analysis for Microarray), 12 genes were strongly predictive of tumour response. Using SAM two class, 30 miRNAs were found differentially expressed between NR and R (24 over- and 6 down-expressed). Anti-correlation analyses, using MAGIA (miRNA and genes integrated analysis), revealed the same 8 miRNAs both in NR and R group, except for miR-630, over-expressed only in NR group. ABCC2 gene, miR-7, miR-182, miR-200a, miR-630, miR-638, and miR-1300 were validated by qPCR, confirming the data obtained by microarray analysis. Conclusions Pre-treatment gene and miRNA expression profiling may be helpful to predict response to pCRT in LARC. Further analyses to confirm these findings are required.

Introduzione Il trattamento standard del cancro rettale localmente avanzato è rappresentato dalla radiochemioterapia preoperatoria (pRCT) seguita dalla chirurgia. Tuttavia, la risposta alla pRCT non è uniforme e non esiste oggi un metodo efficace per predire la risposta tumorale alla pRCT. L'identificazione di pazienti non responsivi alla pRCT potrebbe evitare l'esposizione alla radio- e chemioterapia, trattamenti non scevri da affetti avversi; inoltre l'identificazioni delle risposte complete potrebbe selezionare pazienti candidati ad un trattamento chirurgico meno invasivo. Questo studio si propone di associare profili di espressione genica e di microRNA (miRNA) al grado di risposta tumorale in pazienti affetti da cancro rettale e sottoposti a pRCT. Materiali e metodi Pazienti consecutivi affetti da carcinoma rettale medio-basso localmente avanzato e candidati quindi a pRCT, sono stati sottoposti a biopsie tissutali multiple prima dell'inizio della pRCT. Tutti i pazienti sono stati quindi sottoposti a pRCT standard seguita dalla resezione chirurgica del tumore. Tutti i pezzi operatori sono stati analizzati da uno stesso team di patologi ed in modo standardizzato. Le biopsie con una percentuale di cellule tumorali ≥50% sono state considerate idonee per gli esperimenti. Previo isolamento del RNA, l'espressione genica e di miRNA è stata valutata con tecnica microarray one color (Agilent®). I dati ottenuti sono stati quindi normalizzati sia intra- che inter-array, filtrati e infine clusterizzati. L'espressione genica e di miRNA è stata comparata tra responders (R) e non responders (NR) in base al grado di regressione tumorale (TRG) valutato dal patologo al momento dell'esame del pezzo operatorio. Una validazione dei dati ottenuti con i microarray è stata fatta mediante PCR quantitativa (qPCR). Risultati Sono stati considerati per lo studio 38 pazienti, 16 (42%) R (TRG1-2) e 22 (58%) NR (TRG3-5). Nonostante una prima unsupervised cluster analisi non abbia separato nettamente i due gruppi di pazienti, usando il programma SAM (Significance Analysis of Microarray) two class, 256 trascritti sono risultati differenzialmente espressi tra NR e R (188 sovra- e 68 sotto-espressi). Usando PAM (Prediction Analysis for Microarray), 12 trascritti erano fortemente predittivi di risposta tumorale. SAM two class ha permesso inoltre di evidenziare 30 miRNA differenzialmente espressi tra NR e R (24 sovra- e 6 sotto-espressi). Analisi di anti-correlazione, mediante MAGIA (miRNA and genes integrated analysis), hanno rilevato gli stessi 8 miRNA sia nel gruppo NR che R, ad eccezione di miR-630, sovra-espresso solo nei NR. La validazione mediante qPCR del gene ABCC2 e di miR-7, miR-182, miR-200a, miR-630, miR-638 e miR-1300 ha confermato i risultati dell'analisi microarray. Conclusioni I profili di espressione genica e di miRNA pre-trattamento sembrano essere utili alla predizione di risposta tumorale alla pRCT in pazienti affetti da cancro del retto, tuttavia sono necessari ulteriori studi di validazione per confermare questi risultati e per il loro utilizzo nella pratica clinica.