Role of macrophagic factors in muscle regeneration: in vitro and in vivo characterization

Muscle regeneration is a complex process that involves many different types of cells, both myogenic and non-myogenic. In particular, macrophages play a fundamental role, since they exert many different functions: they phagocyte fiber debris, release cytokines to regulate the inflammatory response and stimulate satellite cells through the secretion of myogenic factors. Importantly, inflammatory processes mediated by macrophages are known to play a major role in the pathophysiology of many inherited muscular dystrophies, such as Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). There are two main classes of activated macrophages: M1 macrophages, which have a pro-inflammatory action, and M2 macrophages that are anti-inflammatory. The exact effect of these two types of macrophages on myogenic cells is still debated, although all Authors state that if given type has a pro-proliferation effect it does not exert a pro-differentiation effect, and vice versa. In order to study the effects of macrophage-released factors onto myogenic cells we use the murine macrophage cell line J774 to obtain a serum-free, macrophage- conditioned medium (mMCM). We previously found that mMCM could enhance the proliferation rate and prevent the trans-differentiation of rat satellite cells, as well as human myoblasts from both normal and dystrophic muscles. Besides, it can greatly enhance the repair processes in muscles that underwent large surgical ablations. As these features could all be very useful in clinical terms to treat inherited and traumatic muscle diseases, we are now trying to clarify the mechanism(s) of action of mMCM. To do so, we have moved to murine in vitro and in vivo models, both wild type (wt) and dystrophic (mdx). In this work, we confirmed the pro-proliferative effect of mMCM on murine satellite cells, both wt and mdx: mMCM significantly shortened their average duplication time from 90 to 48 hours and from 100 to 20 hours, respectively. The results were also confirmed with FACS-sorted wt satellite cells (duplication time reduced from 45 to 31 hours), suggesting that the effects were not limited to a specific subpopulation of satellite cells. At the same time, though, not only mMCM did not inhibit the differentiation process, but in some instances it seemed to enhance them. We also tested the effect of mMCM on the proliferation of primary wt and mdx fibroblasts, finding that mMCM consistently had a clear anti-proliferative effect on mdx fibroblast, while it did not affect wt fibroblasts. Experiments on the effect of mMCM pro-proliferative action on satellite cell transplantation in dystrophic muscle were carried out using GFP+ satellite cells, showing that when recipient muscles were treated with mMCM the number of GFP-positive fibers was higher that in controls. In vivo experiments on wt mice muscles showed that in intact tissue delivery of mMCM does not elicit an inflammatory response; on the other hand, in chemically pre-injured muscles mMCM injections lowered the expression levels of various macrophagic markers, both for M1 and M2, thus indicating that mMCM can interfere with the inflammatory process, apparently reducing the total number of macrophages. In order to further elucidate the possible interactions between mMCM and activated macrophages we also investigated the effects of mMCM on macrophages polarization. To this aim, we used a model in which human monocytes obtained from blood that were differentiated into macrophages and then stimulated with cytokines to acquire either M1 or M2 phenotype. We then tested the effects on mMCM on non-stimulated, M1 and M2 macrophages. These analyses showed that mMCM alone cannot influence macrophages polarization but, when combined with polarization stimuli, it seems to enhance the M1 phenotype. Finally, we began an analysis of mMCM composition, finding that it contains various cytokines, some pro- and other anti-inflammatory. We are also starting the mass spectrometry analysis, and the preliminary results identified some interesting candidates. mMCM also contain exosomes, whose content is however still under investigation. Our data confirm the potential of mMCM as a therapeutic tool for muscular pathologies, but also underline the need of improving our understanding of the complex interplay between macrophages and muscle environment

La rigenerazione muscolare è un processo complesso che coinvolge diversi tipi cellulari, sia miogenici sia non miogenici. In particolare, i macrofagi ricoprono un ruolo fondamentale, svolgendo diverse funzioni: fagocitano i detriti cellulari, rilasciano citochine che regolano la risposta infiammatoria e stimolano le cellule satelliti attraverso la secrezione di fattori miogenici. I processi infiammatori mediati dai macrofagi hanno un ruolo fondamentale nella patofisiologia di molte distrofie muscolari ereditarie, come la Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD). Esistono due classi di macrofagi attivati: i macrofagi M1, che hanno un effetto pro-infiammatorio, e i macrofagi M2, che hanno un’azione anti-infiammatoria. L’esatto effetto di questi due tipi di macrofagi sulle cellule miogeniche è ancora oggetto di dibattito, sebbene tutti gli Autori concordino nell’affermare che se un certo tipo ha un’azione pro-proliferativa sulle cellule, non avrà anche un effetto pro-differenziativo sulle stesse e viceversa. Per studiare l’effetto dei fattori rilasciati dai macrofagi sulle cellule miogeniche, abbiamo utilizzato la linea cellulare di macrofagi murini J774, per ottenere un medium condizionato da macrofagi privo di siero, chiamato murine Macrophage Conditioned Medium (mMCM). In lavori precedenti abbiamo dimostrato che mMCM può aumentare la proliferazione e impedire il trans-differenziamento di cellule satelliti di ratto, nonché di mioblasti umani, sia di individui sani che di pazienti distrofici. Può inoltre migliorare grandemente la rigenerazione in muscoli che hanno subito grosse rimozioni chirurgiche di massa. Tutte queste caratteristiche potrebbero essere molto utili nel trattamento clinico di patologie muscolari sia traumatiche sia ereditarie e stiamo quindi cercando di chiarire quale sia il meccanismo (o i meccanismi) di azione del mMCM. Per far ciò, abbiamo deciso di utilizzare il modello murino in vitro e in vivo, sia selvatico (wild type, wt), sia distrofico (mdx). In questo lavoro, abbiamo confermato l’effetto pro-proliferativo del mMCM sulle cellule satelliti di topo, sia wt che mdx: mMCM ha ridotto significativamente il loro tempo di duplicazione medio rispettivamente da 90 a 48 ore e da 100 a 20 ore. Tali risultati sono stati anche confermati con cellule satelliti wt isolate tramite FACS (tempo di duplicazione ridotto da 45 a 31 ore), indicando che gli effetti visti sulle cellule non sono limitati ad una specifica subpopolazione di cellule satelliti. Allo stesso tempo, mMCM non solo non ha inibito il processo di differenziamento delle cellule, ma in alcuni casi è anche sembrato che lo migliorasse. Abbiamo anche studiato l’effetto del mMCM sulla proliferazione di fibroblasti primari, sia wt che mdx, trovando che mMCM ha un significativo effetto anti- proliferativo sui fibroblasti distrofici, mentre non ha effetto sui wt. Abbiamo poi condotto alcuni esperimenti in vivo per capire l’effetto del mMCM sul trapianto di cellule satelliti in muscolo distrofico, usando satelliti GFP+, e abbiamo dimostrato che se il muscolo ricevente viene trattato con mMCM, il numero di fibre GFP-positive è più alto dei controlli. Gli esperimenti condotti in vivo su muscoli wt intatti hanno mostrato che mMCM da solo non stimola una risposta infiammatoria, mentre la somministrazione di mMCM in muscoli danneggiati chimicamente ha diminuito l’espressione di vari marcatori macrofagici, sia M1 che M2, indicando che mMCM può interferire con il processo infiammatorio, apparentemente riducendo il numero totale di macrofagi. Per indagare più approfonditamente sulle possibili interazioni fra mMCM e i macrofagi attivati, abbiamo poi investigato gli effetti del mMCM sulla polarizzazione di macrofagi. Abbiamo dunque usato un modello in cui monociti umani ottenuti dal sangue sono differenziati in macrofagi e poi stimolati con citochime per acquisire un fenotipo M1 o M2. Abbiamo poi studiato gli effetti del mMCM sui macrofagi già polarizzati o ancora vergini. Queste analisi hanno mostrato che mMCM da solo non può influenzare la polarizzazione dei macrofagi, ma che quando è in combinazione con stimoli polarizzanti, sembra spingere verso il fenotipo M1. Infine, abbiamo iniziato l’analisi della composizione del mMCM. mMCM contiene diverse citochine, alcune pro- e altre anti-infiammatorie. Stiamo inoltre iniziando l’analisi con la spettrometria di massa sul mMCM e i risultati preliminari hanno identificato alcune proteine interessanti. mMCM contiene inoltre anche exosomi, il cui contenuto è ancora oggetto di analisi. I nostri dati confermano il potenziale del mMCM come strumento terapeutico per le patologie muscolari, ma evidenziano anche il bisogno di migliorare le nostre conoscenze sulle complesse interazioni fra macrofagi e ambiente muscolare