Development and Application of a Novel Method for Genome Mapping using Next Generation Sequencing

In this Thesis it is presented a new method to produce genome maps. Genome maps are formed by a set of genetic markers whose sequences and positions on the genome are known and defined. Genetic markers could be any kind of DNA sequence, from genes to even smaller sequences. The entire ordered set of genetic markers of a genome constitute its maps. The availability of a such a map in a genome sequencing project could be very useful. In fact, it provides landmarks along the entire target genome that could be used to produce the final and complete sequence. The aim of the new method proposed in this work is to produce physical maps taking advantage of the next generation sequencing technology. With the high throughput of sequencing that could be reached with these machines any DNA sequence could be a genetic marker. The rationale of this method is to produce profiles of presence and absence of the desired genetic markers. These profiles are produced by sequencing several fractions of the genome, each representing at least its 40-50%. Once these fractions are sequenced it is possible to see, in each of them, which genetic markers are present obtaining the profiles of presence and absence for all genetic marker. The differences in these profiles give information about the distances on the genome of the genetic markers. By comparing all the profiles one another it is possible to see if two markers are close in the genome. In fact, if two profiles are identical it will means that the two markers are physically close. These information could be used to ordinate the markers on the genome producing its complete map. In this work this method is developed and applied. The organism chosen as a test filed is the unicellular algae Nannochloropsis gaditana. Its genome size (around 30 Mbp) was believed to have the right size to be suitable as a test for this genome sequencing project. Moreover, the presence of a parallel project of sequencing its genome offers the chance to compare such a new method with a sequence produced in a classical way

In questa Tesi viene presentato un lavoro svolto nell'ambito del sequenziamento dei genomi. In particolare viene affrontato il problema legato alla creazione di mappe fisiche dei genomi. Le mappe fisiche sono formate da un insieme di informazioni genetiche la cui posizione sul genoma è nota. Queste informazioni genetiche, dette marcatori, possono essere ad esempio geni legati alla manifestazione di caratteri fenotipici. In ultima analisi, comunque, qualsiasi sequenza di DNA può essere considerata un marcatore genetico. Le mappe genomiche sono utlili nel sequenziamento di genomi di nuovi organismi in quanto forniscono dei punti di riferimento per la ricostruzione della sequenza completa. Questo lavoro presenta un nuovo metodo per produrre le mappe genomiche sfruttando le grandi potenzialità offerte dai sequenziatori di nuova generazione. L'idea centrale del metodo è quella di produrre dei profili di presenza e assenza dei marcatori genetici. Questi profili vengono ottenuti sequenziando porzioni di genoma che ne rappresentino al massimo il 40-50%. Per ottenere queste porzioni di genoma viene utilizzata una libreria di cloni BAC. Riunendo un certo numero di cloni selezionati da questa libreria è possibile produrre dei pool di BAC che rappresentano la porzione desiderata di genoma. Tramite il sequenziamento è quindi possibile identificare i marcatori genetici presenti in ciascun pool di BAC producendo così i profili di presenza e assenza. Le differenze tra questi profili sono indicative della distanza fisica tra i diversi marcatori. Una volta prodotti questi profili è quindi possibile compararli tra loro in modo da identificare i profili più simili. Profili simili staranno ad indicare che due marcatori sono vicini sul genoma consentendo quindi di posizionarli vicini in una mappa. Alla fine del processo si otterrà quindi una mappa del genoma. Utilizzando i sequenziatori di nuova generazione è possibile utilizzare qualsiasi sequenza si desideri come marcatore. Questo progetto è stato sviluppato all'intero di un più ampio progetto di sequenziamento del genoma dell'alga unicellulare Nannochloropsis gaditana. Il genoma di questo organismo è stato infatti scelto come prova sul campo per questo nuovo metodo