Amniotic Fluid Stem Cells Improve Survival And Enhance Repair Of Damaged Intestine In Experimental Necrotizing Enterocolitis Via A Cox-2 Dependent Mechanism

Background. Necrotizing enterocolitis (NEC) is a major cause of morbidity and death in neonates. No specific therapy is available and the treatment is only supportive. Amniotic Fluid Stem (AFS) cells represent a novel class of pluripotent stem cells with intermediate characteristics between embryonic and adult stem cells, as they are able to differentiate into lineages representative of all embryonic germ layers and do not form tumors after implantation in vivo. These characteristics, together with the absence of ethical issues concerning their obtainment, make AFS cells good candidates for cell therapy of human diseases. Aim. The aim of this study was to explore the therapeutic potential of Amniotic Fluid Stem (AFS) cells in a rat model of NEC. Methods. AFS cells were obtained from green fluorescent (GFP+) transgenic pregnant rats at 16 days p.c. by c-kit selection. NEC was induced in newborn rats by hyperosmolar milk formula, oral lipopolysaccharide and hypoxia. Rats were divided into 2 groups receiving at 24 and 48 hours of life an intraperitoneal injection of: (i) phosphate buffered saline (PBS; n=120) or (ii) 2x106 AFS cells (n= 121). Additional groups of animals, either injected with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (i.e. rat BM-MSCs) or committed cells (i.e. rat myoblasts), or non subjected to NEC induction (i.e. healthy breast fed newborn rats), were used as additional controls. All groups were blindly compared regarding survival, clinical status, radiological features (abdominal MRI), gut motility (carmine red transit time) and intestinal permeability (plasma lactulose/mannitol ratio). Intestines were blindly analyzed for macro- and microscopic appearance, transcriptional profile (microarray-based expression analysis), neutrophil infiltration (myeloperoxidase activity), enterocyte proliferation (EdU assay) and apoptosis (cleaved caspase 3 immunohistochemistry). AFS cell integration in the gut was evaluated by GFP amplification and immunostaining. Cyclooxygenase 2 (COX2+) cells in the lamina propria were evaluated by immunofluorescence. COX2 activity was inhibited in vivo using selective (celecoxib) and non-selective (ibuprofen) inhibitors; the effects of COX2 pharmacological inhibition on rat survival and clinical status were evaluated. Results. Compared to animals injected with PBS, rats receiving AFS cells survived longer (p<0.0001), and showed: improved clinical conditions (p<0.001), better abdominal appearance at MRI, restored intestinal transit (p<0.01), decreased intestinal permeability (p<0.05), reduced macroscopical (p<0.001) and histological gut damage (p<0.001). These beneficial effects were specific to AFS cells as neither BM-MSCs nor myoblasts were able to improve animal morbidity/mortality in comparison to PBS (p=n.s.). AFS cells integrated in the intestine with various degrees of spreading in all the animals. cDNA arrays comparing the intestinal transcriptional profile of PBS vs. AFS cell rats showed differences in the expression of genes involved in inflammation, apoptosis and cell proliferation which were respectively down-regulated (inflammation and apoptosis) and up-regulated (proliferation) in the AFS cell group. At a protein level, AFS cell rats had lower gut neutrophil infiltration (p<0.05), reduced enterocyte apoptosis (p<0.05) and increased enterocyte proliferation (p<0.0001) compared to PBS rats. In rats treated with AFS cells vs. rats injected with PBS, COX2+ cells in the lamina propria were increased (p<0.001) and repositioned under crypts (p<0.001). Moreover, both the total number of COX-2+ cells per villus unit and the number of cryptal COX-2+ cells inversely correlated with the degree of intestinal damage (p=0.014). The pharmacological inhibition of COX2 activity did not exert any effect in PBS rats, whereas it completely abolished AFS cell beneficial effects on animal survival and clinical behavior. Conclusions. In experimental NEC, AFS cell administration via the intraperitoneal route is associated with reduced animal morbidity/mortality and decreased incidence of NEC. AFS cell beneficial effects seems to be related to decreased intestinal neutrophil infiltration, enhanced enterocyte proliferation and reduced epithelial apoptosis. We hypothesize that is achieved through activation of COX2+ cells in the lamina propria. Stem cell therapy may represent a new therapeutic option for infants with NEC.

Premesse. L’enterocolite necrotizzante (NEC) rappresenta la causa più frequente di insufficienza intestinale in età pediatrica. Non esistono tuttora terapie specifiche per la NEC ed il suo trattamento si basa unicamente sulla terapia medica di supporto e sulla rimozione chirurgica delle porzioni di intestino affetto. Le cellule staminali derivanti da liquido amniotico (AFSC) sono una popolazione di cellule staminali di origine fetale descritta per la prima volta nel 2007. Esse possiedono delle caratteristiche intermedie fra le cellule staminali embrionali (i.e. pluripotenza) e le cellule staminali adulte (i.e. mancata tumorigenicità dopo iniezione in vivo) che le rendono candidati ideali per la terapia cellulare. Scopo dello studio. Valutare il potenziale terapeutico delle cellule staminali derivanti da liquido amniotico (AFSC) in un modello animale di NEC. Materiali e metodi. AFSC sono state derivate da ratti Sprague-Dawley GFP+ (i.e. esprimenti in modo costitutivo la proteina reporter “Green Fluorescent Protein”) al 16^ giorno p.c. tramite immunoselezione per il loro caratterstico marcatore di superficie (i.e. c-kit/CD117). Le cellule ottenute sono state caratterizzate per morfologia e immunofenotipo. La NEC e’ stata indotta in ratti neonati tramite l’utilizzo di elementi simili ai fattori patogenetici implicati nell’insorgenza della NEC umana: alimentazione con latte formulato iperosmolare, eventi ipossici, somministrazione di lipopolisaccaride. I ratti, suddivisi in due gruppi principali, hanno ricevuto a 24 e 48 ore di vita, per via intraperitoneale: i. 50 ul di soluzione salina (PBS; n=120) o ii. 2x106 AFSC (n= 121). Altri gruppi di animali, trattati con cellule staminali mesenchimali di ratto derivanti da midollo osseo o con mioblasti, oppure non sottoposti all’induzione di NEC (i.e. neonati sani allattati al seno), sono stati utilizzati come gruppi aggiuntivi di controllo. I diversi gruppi di animali sono stati valutati in cieco per i seguenti parametri: sopravvivenza, stato clinico, aspetto radiologico intestinale (RM ad alta risoluzione), motilita’ intestinale (studio del tempo di transito con coloranti vitali), permeabilita’ intestinale (rapporto lattulosio/mannitolo plasmatici). L’intestino e’ stato valutato in cieco per: aspetto macroscopico ed istologico, profilo di espressione genica (tramite tecnologia cDNA-microarray), infiltrazione neutrofila (saggio di attivita’ della mieloperossidasi), proliferazione (EdU) e apoptosi degli enterociti (immunoistochimica per caspasi 3 attivata). L’integrazione di AFSC nell’intestino e’ stata analizzata sia tramite PCR (amplificazione del gene gfp) che tramite immunoistochimica (immunofluorescenza per GFP). Il numero e la localizzazione delle cellule stromali esprimenti COX2 nella mucosa sono stati valutati con immunofluorescenza. L’attivita’ di COX2, in vivo, e’ stata inibita farmacologicamente con inibitori selettivi (celecoxib) e non selettivi di COX2 (ibuprofene); gli effetti di tale inibizione sulla sopravvivenza e sulla morbidita’ degli animali trattai con AFSC o PBS sono stati analizzati in cieco. Risultati. La somministrazione di AFSC, per via intraperitoneale a ratti neonati affetti da NEC: migliora significativamente la sopravvivenza degli animali sia rispetto alla somministrazione di PBS (p<0.0001) che di linee cellulari di controllo (i.e. cellule staminali mesenchimali di ratto derivanti da midollo osseo [p=0.024] e mioblasti di ratto [p<0.0001]). Rispetto alla somministrazione di PBS, inoltre, il trattamento con AFSC: i. riduce la morbidita’ degli animali migliorandone l’aspetto clinico (p<0.001); ii. riduce significativamente il danno intestinale sia alla valutazione dell’addome con RM ad alta risoluzione che all’esame macroscopico (p<0.001) ed istologico dell’intestino (p<0.001); iii. migliora significativamente la funzionalità dell’intestino sia per quanto concerne la motilità (p<0.01) che l’assorbimento di nutrienti (p<0.05). AFSC somministrate per via intraperitoneale migrano preferenzialmente verso l’intestino dove, seppur con un basso tasso di integrazione tissutale, sono in grado di localizzarsi in tutti gli strati della parete e talora di differenziarsi in cellule con fenotipo mesenchimale (i.e. cellule muscolari lisce). La somministrazione di AFSC in ratti neonati affetti da NEC è in grado di modificare il profilo di espressione genica dell’intestino incrementando l’espressione di geni coinvolti nella proliferazione e riducendo l’espressione di geni coinvolti in apoptosi e infiammazione. Tali dati di espressione sono stati confermati a livello proteico dimostrando che nell’intestino dei ratti affetti da NEC trattati con AFSC v.s. PBS è maggiore la proliferazione delle cellule epiteliali (p<0.0001), minore l’apoptosi degli enterociti (p<0.05) e ridotta l’infiltrazione neutrofila tissutale (p<0.05). La somministrazione di AFSC, inoltre, determina l’attivazione di una popolazione di cellule stromali esprimenti la ciclossigenasi 2 (COX2) nella lamina propria della mucosa intestinale. Più in dettaglio la somministrazione di AFSC v.s. PBS causa un significativo aumento del numero delle cellule COX2+ nella lamina propria (p<0.001) e un loro spostamento dall’asse del villo alla niche delle cripte intestinali (p<0.001). Tale effetto costituisce il meccanismo d’azione di AFSC poiché la somministrazione in vivo di inibitori selettivi e non selettivi di COX2 (ma non di COX1) a ratti affetti da NEC abolisce gli effetti positivi di AFSC su morbidità e mortalità degli animali ma non ha alcun effetto sugli animali trattati con PBS. Conclusioni. In un modello animale di NEC, AFSC sono in grado di migliorare in modo significativo la mortalita’ e la morbidita’ degli animali e il danno intestinale. AFSC non determinano direttamente tali effetti rigenerando di per sé l’intestino ma indirettamente attivando le cellule stromali esprimenti COX2 presenti nella lamina propria le quali a loro volta stimolano la proliferazione e riducono l’apoptosi delle cellule epiteliali intestinali residenti. Sebbene ulteriori studi siano necessari (e.g. per identificare i fattori/meccanismi molecolari responsabili dell’attivazione delle cellule COX2+), riteniamo che la terapia con cellule staminali derivanti da liquido amniotico possa rappresentare una nuova prospettiva terapeutica per i pazienti affetti da NEC.