Analysis of blood-based markers as predicting tools of pathologic tumour response in rectal cancer patients receiving neo-adjuvant chemoradiotherapy

Neo-adjuvant chemo-radio therapy (pCRT) has been accepted as a standard care in the treatment of patients with locally advanced rectal cancer. The multimodality treatment has been established to improve tumour downstaging, pathological complete response, and local disease control. However, the response of individual tumors to the treament is not uniform and ranges from complete response to complete resistance. The discovery of new molecular markers that predict the tumour response is surely of wide interest for personalizing the therapy and reducing time, costs and side effects in the patients with resistant tumours. Many potential biomarkers have been evaluated in order to predict the response to pCRT, and to implement targeted therapeutics. However, single-marker or multi-markers analyses, based on pre-treatment tissue biopsies, often obtained conflicting results demonstrating the heterogeneity of the individual tumour response. Moreover, the prediction of histopathological response to neo-adjuvant treatment is complicated by the interaction and the involvement of the microenvironment in modulating the sensitivity to pCRT. In this study, we developed blood-based methods of biomarker analysis in order to evaluate the histopathological response to treatment in a broad contest that can take into account not only the signalling pathway of tumour cells but also the microenvironment as a part of a unique system. Indeed, the non-invasive nature and the dynamism for which different molecules could be detected according with physiological and pathological states has given us the possibility to monitor the response along the administration of the treatment. In particular, we focused on two different kind of circulating molecules: the cell-free DNA (cfDNA) and the circulating low molecular weight (LMW) peptides. In particular, we investigated the presence, the quantity of cfDNA and its integrity (cfDNA integrity = non apototic cfDNA / total cfDNA) along the chemo-radio treatment. For this purpose we measured the cfDNA concentration and cfDNA integrity in a prospective study of locally advanced rectal cancer patients plasma collected before the pCRT, after two weeks from initiation of the pCRT and after the pCRT. We evaluated the association of these markers with the histological response to the chemo-radio therapy, demonstrating a different kinetic of cfDNA integrity in association with the tumour response. Then we studied the LMW peptidome circulating in plasma, in order to find evidences of possible differences in the peptide profile that could reflect the tumour response. To overcome the technical difficulties in harvesting LMW species, we have employed the mesoporous chip-based technology, developed by the Nanomedicine Department of The Methodist Hospital Research Institute in Houston, Texas. This mesoporous device, in combination with matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), allows the isolation and the detection of small peptides from the large proteins. We analyzed plasma of rectal cancer patients, with positive or negative response to the therapy, at the same time points as the cfDNA: before, during, after the chemo-radio therapy. Multivariate analyses of the LMW peptide profile at different time points identified combinations of peptides that revealed high discriminating capacity of the different tumour responses. In particular, before the pCRT, a pattern of five ionic species showed a sensitivity and a specificity of 80% and after the pCRT, a pattern of other five specific ionic species showed a sensitivity of 80% and a specificity of 85% to cluster patients on the basis of histopathologic response to pCRT. Moreover the identification of the amino acids sequences of the response-specific ionic species revealed the presence of protein fragments that could be directly or indirectly valuable for further investigation on the resistance mechanisms of the rectal tumour to the neo-adjuvant chemo-radio therapy

La radiochemioterapia neoadiuvante (pCRT) è un protocollo standard accettato per il trattamento di pazienti con cancro rettale localmente avanzato. Il trattamento preoperatorio multimodale è stato introdotto per la riduzione dello stadio del tumore, per l’aumento della risposta completa patologica e per il controllo locale della malattia. Tuttavia la risposta patologica al trattamento non è uniforme e varia da una risposta completa alla resistenza totale. La scoperta di nuovi marcatori molecolari in grado di predire la risposta del tumore è sicuramente di grande interesse al fine di personalizzare la terapia, riducendo così i tempi, i costi e gli effetti collaterali nei pazienti con tumori resistenti. Molti potenziali biomarcatori sono stati valutati con l’obiettivo di prevedere la risposta alla pCRT, e di attuare terapie mirate. Finora molti studi su singolo o multi-marcatore sono stati eseguiti prevalentemente su biopsie di tessuto pre-trattamento. I risultati ottenuti, tuttavia, erano spesso contrastanti dimostrando l'eterogeneità individuale della risposta tumorale al trattamento. Inoltre, la predizione della risposta istopatologica alla pCRT è complicata dall’interazione e dal coinvolgimento del microambiente che può modulare la sensibilità del tumore al trattamento. In questo studio, abbiamo sviluppato metodi di analisi di biomarcatori su sangue, al fine di valutare la risposta del tumore al trattamento in un contesto più ampio, che rende conto non solo dell’ambiente strettamente tumorale, ma che prende in considerazione anche il microambiente come parte di un sistema unico. Infatti, la natura non invasiva del materiale biologico analizzato e il dinamismo per cui molecole differenti possono essere rilevate secondo lo stato fisiologico e patologico dell’organismo, ci hanno permesso di monitorare la risposta lungo il tempo di somministrazione del trattamento. In particolare, ci siamo concentrati su due diversi tipi di molecole circolanti: il DNA libero da cellule (cfDNA) e i peptidi a basso peso molecolare (Low Molecular Weight, LMW). In particolare, abbiamo studiato la presenza, la quantità e l’integrità del cfDNA durante il trattamento radio-chemioterapico. A questo scopo abbiamo misurato la concentrazione e l'integrità del cfDNA (cfDNA integrity=cfDNA apoptotico/cfDNA totale) in uno studio prospettico di plasma di pazienti con carcinoma rettale localmente avanzato, raccolto prima della pCRT, dopo due settimane dall'inizio del trattamento e dopo la pCRT. Abbiamo valutato l'associazione di questi marcatori con la risposta istologica alla chemio-radio terapia, dimostrando la presenza di diversa cinetica nell’integrità del cfDNA, in associazione con la risposta tumorale. Nel plasma, abbiamo quindi studiato il peptidoma circolante a basso peso molecolare, al fine di trovare potenziali differenze nel profilo peptidico che potessero riflettere la risposta tumorale. Per superare le difficoltà tecniche nella rilevazione dei peptidi circolanti a basso peso molecolare, abbiamo utilizzato una strategia basata sull’esclusione dimensionale di un chip di silice mesoporosa (MSC), sviluppato dal Dipartimento Nanomedicina del The Methodist Hospital Research Institute di Houston, Texas. Questo dispositivo mesoporoso, in combinazione con l’utilizzo dello spettrometro di massa MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight Mass Spectrometry), consente l'efficiente rimozione di grandi proteine e l'isolamento del peptidoma circolante da campioni di fluidi corporei. Abbiamo analizzato il plasma di pazienti con cancro rettale, prelevato in diversi tempi (prima, durante, dopo la chemio-radio terapia) e stratificati secondo la risposta positiva o negativa alla pCRT. L'analisi multivariata del profilo peptidico nei diversi tempi di analisi ha identificato combinazioni di peptidi che evidenziavano un’elevata capacità discriminante della risposta tumorale. In particolare, il modello di regressione logistica ha evidenziato, prima della pCRT, una combinazione di cinque specie ioniche capace di identificare i pazienti che non rispondono al trattamento, con una sensibilità e una specificità del 80%; mentre la stessa analisi con i campioni raccolti dopo la pCRT, ha identificato un'altra combinazione di cinque specie ioniche che evidenziano una sensibilità del 80% e una specificità del 85%. Inoltre, l'identificazione delle sequenze amminoacidiche di alcune tra le specie ioniche discriminanti la risposta alla pCRT, hanno rivelato la presenza di frammenti proteici che possono essere direttamente o indirettamente utili per ulteriori indagini sui meccanismi di resistenza del tumore rettale alla radio-chemio terapia neo-adiuvante