Interaction between tumour and microenvironment - molecular mechanisms of cell migration in canine tumours

Different steps forward have been made in the recent years to identify the molecular determinants in carcinogenesis and the evidence of a multistep process where cancer cells accumulate multiple and consecutive genetic alterations has been formulated. Recently, tumour progression has been recognized as the product of a complex crosstalk between tumour cells and their surrounding and supporting tissue, named tumour stroma. This stroma is known to influence the growth of cancer and it is composed by several types of cells, including endothelial cells of blood and lymphatic circulation, stromal fibroblasts and a variety of bone marrow-derived cells, such as macrophages, mast cells, neutrophils, lymphocytes and mesenchymal stem cells. The supportive microenvironment is generate and modulated by cancer cells through the production and activation of stroma growth factors including vascular endothelial growth factor (VEGF), platelet-derived growth factor (PDGF) and transforming growth factor-beta (TGF-beta). Concomitant with altered growth-factor expressions, induced by their autocrine and paracrine effect on the tumour and stromal cells, cancer cells are able to produce proteolytic enzymes, such as Matrix metalloproteinases (MMPs), which operate the remodelling of extracellular matrix (ECM) and basement membrane, thus activating cell-surface and ECM-bound growth factors. All these processes are described to contribute to the extensive crosstalk between the microenvironment and the cancer cells. Therefore, the microenvironment is implicated in the regulation of cell growth, determining angiogenesis, tumour invasion and metastasis, and impacting the outcome. Even if stromal cells are not malignant, their role in supporting cancer growth is vital to the survival of the tumour. For this purpose, cells of microenvironment have become an attractive target for therapeutic agents. The present project has been divided in different tasks to identify the molecular mechanisms implicated in cell migration, angiogenesis and tumour growth led by stroma cells and their crosstalk with cancer cells in different neoplasia in dog. Canine mammary tumour, cutaneous mast cell tumour, lymphoid leukaemia and lymphoma were selected for the study and gene expression profiling and proteomic analysis of different growth factors (VEGF-TGF-beta-PDGF) and MMPs were analyzed in association with their possible prognostic and predictive role and crosstalk. Several important results have obtained highlighting the background of the tumour progression and the role of microenvironment in veterinary oncology. Selected results are shown below: - MMP-2, MT1-MMP, MMP-9 were significantly involved in canine mammary tumour and a significant role of the stromal compartment was described; - MMP-9 and VEGF-A were associated with the histological tumour grade in cutaneous mast cell tumour; - MMP-9, MT1-MMP, TIMP-1 and VEGF were correlated in T-cell lymphoma and in dogs with higher stage; - A potential role of MT1-MMP and TIMP-2 in the pathogenesis of canine acute lymphoblastic leukaemia has been discovered; - In chronic lymphocytic leukaemia, residual normal leukocytes have shown a significative influence in the expression of MMP-9, MT1-MMP, VEGF and TIMPs; - Lymphoma and leukaemia in vitro model exhibited a significative discrepancy that enhanced the importance of microenvironment in vivo; - PDGF-B mRNA expression was identified in canine T-cell lymphoma and cutaneous lymphomas. A functional autocrine and/or paracrine loop of growth stimulation was proposed due to the co-expression of PDGFs and PDGFRs at different time point during disease. Therefore, the obtained results may significantly improve the understanding of cancerogenesis of the most frequent tumours in dogs. The summarized data here show a primary role for the microenvironment during carcinogenesis. Development of novel cancer therapies that target the process of metastasis formation, tumour growth and differentiation, by interfering with the ability of cancer cells to transmigrate into blood and lymph vessels and to invade the connective tissue, is widely expected in veterinary oncology. Further data are necessary to indicate that the use of chemopreventive agents to control the function and behaviour of cells in the microenvironment might be an important approach to the overall control of cancer.

Negli ultimi anni nell’ambito dell’oncologia, diversi studi hanno identificato diverse molecole target implicate nella cancerogenesi e sono stati evidenziati numerosi processi attraverso cui le cellule tumorali sono in grado di accumulare alterazioni genetiche. Recentemente, la progressione del tumore è stata riconosciuta come il prodotto di un complesso crosstalk tra le cellule tumorali e il tessuto circostante, chiamato stroma tumorale. Questo stroma è noto per influenzare la crescita del tumore ed è composto da diverse tipologie cellulari, che comprendono cellule endoteliali della circolazione sanguigna e linfatica, fibroblasti stromali ed una varietà di cellule derivate dal midollo osseo, come macrofagi, mastociti, neutrofili, linfociti e cellule staminali mesenchimali. Ulteriormente, il microambiente di supporto è generato e modulato da cellule tumorali attraverso la produzione e attivazione di fattori di crescita prodotti dallo stroma stesso, come Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) e Transforming Growth Factor-beta (TGF). Concomitante all’alterata espressione di questi fattori e per il loro effetto autocrino e paracrino sulle cellule tumorali e su quelle stromali, le cellule neoplastiche iniziano a produrre enzimi proteolitici, come metalloproteasi di matrice (Matrix metalloproteinases - MMPs). Le MMPs operano il rimodellamento della matrice extra cellulare e della membrana basale, attivando così fattori di crescita legati alla superficie cellulare e alla matrice stessa. Tutti questi processi contribuiscono all’esteso crosstalk tra il microambiente e le cellule tumorali. Il microambiente quindi è implicato nella regolazione della crescita cellulare, determinando neoangiogenesi, invasione, metastasi tumorali e influenzando il risultato della terapia. Anche se le cellule stromali non sono considerabili fenotipicamente maligne, il loro ruolo nel sostenere la crescita della neoplasia è essenziale per la sopravvivenza del tumore. Con questo presupposto, le cellule del microambiente sono diventate un bersaglio attrattivo per diversi agenti terapeutici. Il progetto di ricerca è stato suddiviso in diverse fasi per identificare i meccanismi molecolari implicati nella migrazione cellulare, nell'angiogenesi e nella crescita neoplastica, da parte di cellule stromali e dal loro crosstalk con le cellule tumorali, in diverse neoplasie del cane. Per lo studio sono state selezionate le tipologie tumorali più frequenti nel cane: tumore mammario, mastocitoma cutaneo, leucemie linfoidi e linfoma, analizzando i profili di espressione genica e proteica di diversi fattori di crescita (VEGF-TGF-beta-PDGF) e delle MMPs, in associazione al loro crosstalk e ad un loro eventuale ruolo prognostico. Sono stati ottenuti importanti risultati evidenziando lo scenario della progressione tumorale e il ruolo del microambiente in oncologia veterinaria. E’ stato dimostrato che: - MMP-2, MT1-MMP, MMP-9 sono significativamente coinvolte nel tumore mammario ed è stato descritto un loro ruolo rilevante del compartimento stromale; - MMP-9 e VEGF-A sono associati al grado istologico nei mastocitomi cutanei; - MMP-9, MT1-MMP, TIMP-1 e VEGF sono correlate nel linfoma T e nei cani con linfoma con stadio clinico più alto; - MT1-MMP e TIMP-2 hanno un ruolo nella patogenesi nelle leucemie linfoblastiche acute; - Nella leucemia linfocitica cronica, i leucociti residui normali mostrano un'influenza significativa nell'espressione di MMP-9, MT1-MMP, VEGF e dei TIMPs; - Il linfoma e la leucemia nel modello in vitro mostrano una considerevole discrepanza per alcune MMPs e VEGF che avvalora l'importanza del microambiente in vivo; - L’espressione genica del PDGF-B è significativa nei linfomi T e nei linfomi cutanei. E’ stato inoltre proposto un loop funzionale autocrino e/o paracrino di stimolazione della crescita della neoplasia, dovuto alla co-espressione dei PDGFs e dei recettori in diversi tempi durante la malattia. I risultati ottenuti potrebbero migliorare significativamente la comprensione della cancerogenesi nei tumori più frequenti nel cane. I dati qui sintetizzati mostrano un ruolo primario del microambiente durante la carcinogenesi. Lo sviluppo di nuove terapie antitumorali che colpiscano il processo di formazione di metastasi, la crescita e la differenziazione della neoplasia, interferendo con la capacità delle cellule tumorali di trasmigrare nel sangue e nei vasi linfatici e di invadere il tessuto connettivo, sarà ampiamente perseguito in oncologia veterinaria nel futuro prossimo. Sono però necessari ulteriori studi per indicare se l'uso di agenti chemio-preventivi per controllare la funzione ed il comportamento delle cellule nel microambiente possa essere un importante approccio al controllo complessivo del cancro.