Production and Characterization of New Baeyer-Villiger Monooxygenases

The Baeyer-Villiger reaction is a very important oxidative reaction in organic synthesis that leads to the production of optically pure esters and lactones from ketones. It is typically performed by peroxyacids, oxydative reagents that are toxic, hazardous and lacking selectivity. By using "green chemistry", it is possible to perform the same reaction using "bio-catalyzers", enzymes named Baeyer-Villiger monoxygenases (BVMOs), a group of avin dependent monooxygenases, that use NAD(P)H and molecular oxygen in order to catalyze chemo-, regio-, and enantio-selective oxidative reactions. BVMOs have been identied in a large number of bacteria and fungi but only a restricted number of them is available in recombinant form. In order to discover novel BVMOs, new sources of enzymes will become important. Using bioinformatics tools, we have identied and selected ve new putative type I BVMOs from dierent organisms: Oryza sativa (Os; plant), Physcomitrella patens (Pp; moss), Cyanidioschyzon merolae (Cm; red alga), Trichodesmium erythraeum (Te; cyanobacterium), Haloterrigena turkmenica (Ht; archeabacterium). In particular, basing on most updated literature, the photosynthetic eukaryotes Oryza, Physcomitrella and Cyanidioschyzon would result very uncommon sources for BVMOs. The cloning and expression strategy used was the same for all the ve putative sequences. The very low solubility of the expressed proteins was the real bottleneck of the work. To overcome the solubility problem many strategies have been performed lowering the inducer concentration, the growth temperature and using chaperones. Adding on the culture an excess of ribo avin, the precursor of the FAD, results successful to obtain soluble avoproteins from Physcomitrella patens and Cyanidioschyzon merolae, showing the importance of the avin cofactor in the folding process. A biocatalytic characterisation of both expressed proteins was made at the Molecular Enzymology group of the Groningen Biomolecular Science and Biotechnology Institute (GBB), University of Groningen (The Netheralnds) headed by Prof. Dr. M.W. Fraaije, a main expert in avoenzymes and particularly in Baeyer-Villiger monooxygenses. Once veried their Baeyer-Villiger monooxyge-3 nase activity a condition optimization (pH, temperature and stability) has been performed; then the two proteins were tested to investigate their substrate speci-city. A steady-state study was carried out in order to obtain kinetics parameters and many conversions were made to determine their selectivity prole. The work presented led to discover new type I BVMOs enlarging the possibility to nd out novel and promising biocatalysts for oxidative reactions.

La reazione di Baeyer-Villiger è una reazione di ossidazione di grande interesse sintetico in chimica organica e consiste nella conversione di composti carbonilici nei corrispondenti esteri o lattoni. L'approccio classico per eseguire la reazione di Baeyer-Villiger prevede l'utilizzo di agenti ossidanti quali perossidi o perossiacidi; questi catalizzatori sono tuttavia il più delle volte intrinsecamente insatabili e/o tossici mancando anche di enantioselettività. Ciò ha portato allo sviluppo di differenti sistemi catalitici che hanno implementano il concetto di "green chemistry" quali gli enzimi, utilizzati come biocatalizzatori. Gli enzimi che in natura catalizzano la reazione di Baeyer-Villiger sono flavoenzimi chiamati "Bayer-Villiger monoossigenasi" (BVMOs). Ad oggi solo pochi geni codificanti per le BVMOs sono stati clonati ed espressi e ciò ha rappresentato sicuramente un grosso ostacolo verso l'applicazione industriale di questa classe di enzimi. Attraverso un'analisi bioinformatica è stato possibile identicare cinque sequenze codificanti proteine ritenute BVMOs putative, le quali presentano al loro interno il motivo caratteristico delle BVMOs di tipo I (FxGxxxHxxxW). Gli organismi individuati sono stati i seguenti: Oryza sativa (pianta), Physcomitrella patens (muschio), Cyanidioschyzon merolae (alga rossa), Trichodesmium ery-thraeum (cianobattere), Haloterrigena turkmenica (archeobattere). In particolare gli eucarioti fotosintetici Oryza, Physcomitrella e Cyanidioschyzon risultano fonti di BVMOs alquanto inusuali, considerando che fino ad oggi questi enzimi sono stati identificati solamente in batteri e funghi. La strategia di clonaggio e di espressione utilizzate è stata la stessa per tutte e cinque le sequenze identificate. La bassa solubilità delle proteine espresse si è rivelata il fattore limitante di tutto il lavoro. Le strategie utilizzate per migliorare la solubilità proteica sono state quelle che hanno portano a una diminuzione della velocità della sintesi proteica come ad esempio la diminuzione della temperatura di crescita di coltura e la diminuzione della concentrazione dell'induttore. Un fattore risolutivo è stato l'aggiunta al terreno di coltura di riboflavina, il precursore del FAD, il quale ha permesso di ottenere in forma solubile le proteine putative da Physcomitrella patens e Cyanidioschyzon merolae, dimostrando inoltre l'importanza del cofattore flavinico nel processo di ripiegamento proteico. La caratterizzazione biocatalitica delle proteine espresse è stata eseguita presso il gruppo di Biocatalisi del Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute (GBB), University of Groningen (The Netheralnds), guidato dal Prof. Dr. M.W. Fraaije, esperto in flavoproteine. Confermata la loro attività come Baeyer-Villiger monoossigenasi è stata eseguita un'ottimizzazione delle condizioni di reazione (in termini di pH, temperatura e stabilità) ed è stata investigata la loro specifità di substrato. In seguito sono stati determinati i parametri cinetici per ciascun enzima e infine sono state eseguite delle bioconversioni con diversi substrati per capire il loro profilo di selettività. Il lavoro riportato ha portato alla scoperta di nuove Baeyer-Villiger monoossigenasi di tipo I, ampliando il panorama di nuovi promettenti biocatalizzatori ossidoriduttivi.