Role of protein kinase CK2 in the targeting of LSD1 and regulation of chromatin condensation: implication of the C-terminal segment of CK2a

CK2α subunit contains four proline-directed phosphorylation sites on its C-terminal tail, which are phosphorylated in cell progressing through normal mitosis by Cyclin dependent kinase 1 (Cdk1). These phosphorylations play an important role in the regulation of CK2, considering that cell with transient expression of phospho-mimic mutant CK2αT344E/T360E/S362E/S370E (CK2α4E) show a defective mitosis. Our data confirm the implication of CK2 in the mitotic regulation and disclose a precise role for the phosphorylated CK2α; indeed the phospho-mimic mutant CK2α4E preferentially phosphorylates few endogenous substrates in comparison to wild type. One of these is the Lysine Specific histone Demethylase 1 (LSD1). LSD1, an important player of the epigenetic machinery, can either repress or activate target genes by catalyzing the demethylation at Lys4 or 9 of H3 histone. Phosphorylation of human LSD1 by CK2 has been confirmed in vitro and the kinetic constants have been determined. Furthermore, mass spectrometry analysis revealed that LSD1 is phosphorylated at several sites, Ser131, Ser137 and Ser166, in its N-terminal domain. This region of LSD1 (1-178) is not crystallographically aviable, in contrast to the AOD domains (179-852) and it has been supposed to play a regulatory function. The molecular modeling of this region suggests a metastable conformational state with Ser131, Ser137 and Ser166 exposed to the solvent. To confirm the existence of this functional interaction between LSD1 and CK2 in vivo, two transfection vectors (pTP6-Ko/Flag-LSD1) have been generated, expressing mutants of LSD1, a phospho-defective and a phospho-mimic mutant, Ser131Ala and Ser131Glu respectively. These tools have been exploited to confirm the key-role of Ser131 phosphorylation in the regulation of LSD1 in cells. The expressions of several known LSD1 affected mRNAs were detected by Quantitative Real time PCR, disclosing correlation between LSD1 mutation and its biological activity. In particular, mRNA level and also protein expression of the transcription factor FoxA2 were decreased by the LSD1 Ser131Glu mutant, but remained unaltered when LSD1 Ser131Ala mutant was expressed, consistent with a relationship between Ser131 phosphorylation and FoxA2 transcription. Furthermore, the transfection of flagged LSD1 allowed the immunoprecipitation of the LSD1 complex in HEK293T cells. Our data disclose that CK2α is an interactor of LSD1 in cells. Performing kinase assay with [ϒ-33P]ATP in IPs, the phosphorylation of LSD1 by a co-immunoprecipitated kinase was detected. The very specific CK2 inhibitor CX-4945 reduced the phosphorylation of LSD1 in IPs, confirming that CK2 is the kinase responsible for this phosphorylation.

La subunità CK2α contiene quattro motivi prolina diretti, localizzati al C-terminale, che sono fosforilati dalla Chinasi Ciclina Dipendente 1 (Cdk1). Queste fosforilazioni sono molto importanti per la regolazione di CK2, infatti, le cellule transientemente transfettate con un costrutto che mima costitutivamente la fosforilazione CK2αT344E/T360E/S362E/S370E (CK2α4E) mostrano come fenotipo una mitosi aberrante. I nostri dati confermano l'implicazione di CK2 nella regolazione mitotica e definiscono un preciso ruolo per CK2α fosforilata; infatti il mutante fosfo-mimetico CK2α4E è in grado di fosforilare in maniera preferenziale alcuni substrati. Uno di questi è la istone Demetilasi Lisina Specifica 1 (LSD1). LSD1 è un importante attore dell'epigenetica. Esso reprime o attiva la trascrizione del gene bersaglio mediante la rimozione di gruppi metile dalla Lisina 4 o 9 dell'istone H3. La fosforilazione di LSD1 ricombinante umana è stata confermata in vitro e le costanti cinetiche sono state determinate. Tramite analisi di spettrometria di massa sono stati identificati i residui fosforilati: Serina131, Serina137 e Serina166. Tutti i fosfositi appartengono alla regione N-terminale di LSD1 (1-178), che non è osservabile nella struttura cristallografica (AOD 179-852) e che è già stata ipotizzata come regione regolatoria. Un'analisi bioinformatica del tipo "molecular modeling" suggerisce questa regione come metastabile ed evidenzia che la Ser131, Ser137 e la Ser166 sono esposte al solvente. Per confermare l'esistenza di un'interazione funzionale tra CK2 e LSD1 sono stati generati due vettori di transfezione (pTP6-Ko/Flag-LSD1), uno con la mutazione fosfo-difettiva Ser131Ala e l'altro con la mutazione fosfo-mimetica Ser131Glu. Questi costrutti hanno permesso di confermare il ruolo chiave esercitato dalla fosforilazione di LSD1 in cellule. Mediante la tecnica "quantitative Real time PCR" alcuni mRNA modulati comunemente da LSD1 sono stati determinati, e dati riguardo l'attività dei mutanti di LSD1 sono stati raccolti. In particolare, la quantità di mRNA del fattore di trascrizione FoxA2 era ridotta dal mutante Ser131Glu, ma risultava inalterata in cellule che esprimevano il mutante Ser131Ala, in accordo con l'ipotesi che esista una relazione tra la fosforilazione della Ser131 e la trascrizione di FoxA2. Inoltre, la transfezione di LSD1 "Flaggata" ha permesso di eseguire l'immunoprecipitazione del complesso di LSD1 in cellule HEK293T. Questa procedura ha dimostrato che CK2α è un interattore di LSD1 in cellule; inoltre effettuando un saggio chinasico con [ϒ-33P]ATP sul campione immunoprecipitato, è stata rilevata la fosforilazione di LSD1 da parte di una chinasi presente nell'immunocomplesso. L'inibitore specifico di CK2, CX4945 (30 nM) riduceva la fosforilazione di LSD1 e confermava che CK2 è la chinasi responsabile di questo evento