Chitin is the second most abundant structural biopolymer, present in human pathogens and in human foods, such as arthropods and fungi (Muzzarelli et al., 2012). Humans have two enzymatically active Chitinases, coded by 2 paralogous genes: Chitotriosidase (CHIT, gene CHIT1) and Acidic Mammalian Chitinase (AMCase, gene CHIA). CHIT has an optimum pH of 6 and is expressed in macrophages and found prestored in neutrophil granules, and over-expressed during malaria infection, so takes part to innate immunity (Musumeci & Paoletti, 2009). Interestingly, the enzymatic deficiency of CHIT (due to a 24-bp duplication on CHIT1 exon 10, named Allele H) is frequent in many human populations (Gianfrancesco & Musumeci, 2004), suggesting that chitinolytic function could be redundant for this Chitinase (Piras et al., 2007). AMCase is expressed mainly in epithelial cells, and over-expressed in alternatively activated macrophages, during Th2 (T-helper type 2) humoral responses to helminth parasites and during asthmatic responses to chitin particles, suggesting that AMCase maintains the immunologic function and take part to immune disorders (Reese et al., 2007). AMCase is also expressed in stomach, but not in duodenum and gut (Boot et al., 2005), and showed chitinolytic activity in human gastric secretions (Paoletti et al., 2007). Indeed, this enzyme exerts enzymatic activity at different pH levels: pH 2, 4.6 and 7, characteristic of stomach, lysosomes and lung respectively (Seibold et al., 2009). Three non-synonymous SNPs on CHIA exon 4 are known to cause three amino-acidic changes in proximity of the catalytic-domain, so to directly influence the pH specificity of the isoforms (Olland et al., 2009). This PhD study investigates Chitinase functional variants in 5 Amerindian populations of Peruvian Amazon and Andes, respect to the main environmental factors of chitin exposure: the indigenous diet, specifically the consumption of arthropods, and intestinal parasites. Methods Ethnobiological descriptive study of the traditional diet, especially insects and crustaceans. Copro-parasitological analysis, for eggs/oocysts/larvas detection and determination, of 76 Amerindians from 3 communities of Awajún, Ashaninka and Shipibo peoples. Difference-similarity statistical analysis between Peruvian Amerindians and world-wide human populations, based on the distribution of chitincontaining parasites (GIDEON database). Genotyping of CHIT1 duplication by sequencing and electrophoresis, from 85 Amerindians and 50 urbanized controls, see Piras (2007). To sequence CHIA gene in 9 Amerindians, and promoter region and exon 4 in a sample of 75 Amerindians and 29- 39 controls, respectively. Enzymatic restriction for the detection of the known variant on exon 12. Analysis of human diversity of CHIA gene based on 14 populations (ENSEMBL database). Results Chitin exposure was assessed in relation to the main environmental factors: arthropods-based diet (species) and high enteroparasites’ prevalence. Ethnobiological data confirmed traditional dietary habits: in Awajún, Ashaninka, Quechua-Lamas was observed an alimentation based on wild biodiversity, including daily consumption of insects, crustaceans and fungi. Also Shipibo people confirmed inset consumption and other traditional dietary habits before migrating to Lima. In the three populations interested by parasitological analysis was assessed a high prevalence of enteroparasites: 35-43% for nematodes, 35-61% for protozoans and 3-29% for Hymenolepis nana. The main chitin-containing parasites found in this sample population were the protozoan Giardia lamblia, Entamoeba histolitica; and the macroparasites Ancylostoma/Necator, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichiuris trichura and Hymenolepis nana. Differently, westernized food habits and lower parasite prevalence (2-12%) characterize the control population of urbanized Peruvians. The comparative analysis of enteroparasites’ distribution in human populations showed that Amerindians are exposed to a reduced pattern of chitin containing macro-parasites, and the most severe ones (trematodes and filarial nematodes) are absent in rural andean-amazonic Peru, as confirmed in other studies conducted in Peruvian Amazon (Ibanez et al., 2004; GIDEON database). The 24-bp duplication causing catalytic deficiency resulted highly conserved, with a frequency of 47.06% in the whole Amerindian sample, and 27.55% in Peruvian controls. This frequency rate is the second highest worldwide, after Chinese Han population (Choi et al., 2001; Piras et al., 2007). Genotypic frequencies were consistent with the Hardy Weinberg Equilibrium, within each indigenous population and in total Amerindians (X²= 0.006; p = 0.939), excluding the presence of selective pressure on this allele. Peruvian control population has the highest, even not significant, deviation from expected values (p = 0.091). CHIA exon 4 encodes for the catalytic domain of Acidic Mammalian Chitinase, and 3 SNPs (A290G, G296A, G339T) are known to determine pH optimum of enzymatic activity. The “AGG” haplotype, wild-type in Humans, is conserved in Peruvian Amerindians, with a frequency of 96% and a high degree of homology and homozygosis within and among the five populations. Is known that this isoform maintains the enzymatic activity at lysosomes’ pH of 4.6, but at stomach pH (2), and lung pH (7), it is respectively reduced and ablated (Seibold et al., 2009). From the analysis of the entire gene sequence, by considering the allelic frequency distribution and Fst between pairs of populations, emerged several relevant polymorphisms, rare in humans and fixed in Amerindians. Variants rs12023321, rs35042265, rs4554721, rs4442363, rs11102235, rs34698010, rs12026825, rs2275253 (exon 10), rs2256721 (exon 12), presenting high frequencies of the derived allele (93-95%), and rs12033184, rs4546919, re2275254 (exon 11), presenting the ancestral allele. Discussion Both ethnobiological and parasitological studies gave evidences of a conserved traditional lifestyle, strongly influenced by environmental factors and, specifically, by high exposure to chitin-containing parasites (especially helminths) and unconventional foods, including chitinous invertebrates. However parasite diversity showed that Amerindians do not suffer parasitoses from histozoic species like trematods (Schistosoma and Fasciola), Taenia sp., and filarial nematodes, that have complex lifecycles inducing granulomas and fibrosis in different human organs (liver, brain, lymphatic system etc.) (Jackson et al., 2009; Anthony et al., 2007). Even if no correlation analysis between Chitinases’ genotype and parasite infection is possible with present data, Chitotriosidase inactive variant is absolutely high and higher respect to controls, thus we can deduce that the reduced pattern of chitin-containing enteroparasites isn’t acting any selective pressure for the functional Chitotriosidase, in our sample. We can also exclude that the functional variant is conserved in control population (WT freq: 73%) because of enteroparasites’ pressure, which are scarce in urban areas. Rather, mixing with Europeans and Africans during last centuries may have determined high WT frequencies in non-ethnic Peruvians. The inactive variant is absent in non-human primates, and in most African populations, and Asiatic populations - Chinese Han (58%) (Chien et al., 2005) y India (40%) (Choi et al., 2001) – have the highest frequencies, suggesting that this “mutation” occurred after human migration out of Africa (Piras et al., 2007). Considering that first inhabitants of New World descend from eastern-Asia populations, is it plausible that the duplication is highly conserved for a founder effect in all South American Amerindians. The CHIA coding sequence and promoter present a specific haplotype, with many loci with high frequency of the derived allele (93-96%), most rare in Africans and Europeans (<30%), so candidates for positive selection. Such variants are localized in promoter region and in the last three exons (10, 11 and 12), coding for the chitinbinding domain, therefore a functional reorganization involving gene expression and chitin-binding site is probable in South Amerindians. Intriguingly, these three nonsynonymous variants are associated with Th2 asthmatic phenotypes in Central Americans and Europeans, suggesting further links between man-helminths coevolution, AMCase functionality and immunologic disorders (Anthony et al., 2007). Only the polymorphism re2275254 (T1218C, Phe354Ser), on exon 11, presented high frequencies of the ancestral allele in tropical Africa and South America, and lower frequencies in temperate regions of Asia and Europe. This is a relevant feature of geographic distribution for functional alleles (Coop et al., 2009), evidently associated to the latitudinal variation of parasites’ distribution.

La chitina è un polisaccaride-azotato insolubile presente in strutture di patogeni dell’Uomo e in alimenti come artropodi e funghi (Muzzarelli et al., 2011). Gli esseri umani hanno due chitinasi enzimaticamente attive, codificate da due geni paraloghi: Chitotriosidasi (CHIT, gene CHIT1) e Acidic Mammalian Chitinase (AMCase, gene CHIA). CHIT ha massima attività enzimatica a pH 6, si esprime nei macrofagi, ed è sovra-espressa durante infezione malarica, pertanto prende parte alla risposta immunitaria innata (Musumeci et al., 2005). È interessante notare che la deficienza enzimatica di CHIT1 (dovuta ad una duplicazione di 24 bp sull’esone 10 di CHIT1) è frequente in molte popolazioni umane, e assente negli altri primati (Gianfrancesco & Musumeci, 2004), suggerendo che la funzione chitinolitica, per questa chitinasi, potrebbe essere ridondante nell’uomo (Piras et al., 2007). AMCase è espressa prevalentemente in cellule epiteliali, e sovra-espressa in macrofagi specializzati attivati durante risposte immunitarie umorali Th2 (T-helper di tipo 2) a infezioni da elminti parassiti e durante risposte asmatiche a particelle di chitina, suggerendo che AMCase mantiene la funzione immunologica e prende parte a disturbi del sistema immunitario come atopie ed asma (Reese et al., 2007). AMCase si esprime anche nello stomaco, ma non nel duodeno e nell'intestino (Boot et al, 2005). Infine, esercita attività enzimatica a pH 2 , 4.6 e 7, caratteristici di stomaco, lisosomi e polmoni, rispettivamente (Seibold et al, 2009), difatti le secrezioni gastriche umane esercitano attività chitinolitica dovuta a AMCase (Paoletti et al, 2007; Cozzarini et al, 2009). Obbiettivi Studiare il binomio chitina-chitinasi in comunità native dell’Amazonia e Ande del Perú, che vivono in condizioni di elevata esposizione a chitina ambientale, rispetto a un gruppo controllo di popolazione urbanizzata. Descrivere due dei principali fattori di esposizione alla chitina: la dieta e gli elminti. Con un approccio evoluzionistico e il supporto di differenti strumenti bioinformatici, verranno discusse le possibili correlazioni tra la variabilità genetica delle chitinasi e la diffusione di parassiti intestinali e distubi associati alle chitinasi, nelle popolazioni mondiali. Metodi Studio etnobiologico descrittivo della dieta tradizionale, soprattutto di insetti e crostacei. Analisi copro-parassitologica per individuazione e determinazione di uova/oocisti/larve in 76 amerindi di origine Awajun, Ashaninka e Shipibo. Analisi statistica di similarità–distanza tra gli Amerindi e casi studio in diverse popolazioni mondiali, in base alla prevalenza di parassiti contenenti chitina (database GIDEON). Genotipizzazione della duplicazione CHIT1 mediante sequenziamento e elettroforesi, in 85 Amerindi e 50 controlli urbanizzati. Sequenziamento del promotore e esone 4 di CHIA (75 Amerindi, e 39 controlli, rispettivemente). Restrizione enzimatica per genetipizzare la variante nota sull’esone 12, in parte del campione. Studio della variabilitá del gene CHIA in 14 popolazioni (database ENSEMBL). Risultati I dati etnobiologici hanno confermato, in Awajún, Ashaninka, Quechua-Lamas, una alimentazione basata sulla biodiversità selvatica, tra cui il consumo giornaliero di insetti, crostacei e funghi; gli Shipibo che vivono a Lima hanno confermato abitudini alimentari tradizionali e consumo di artropodi prima di migrare; i Quechua del Cusco (3000-4000 mslm), consumano saltuariamente larve di coleottero e bruchi. Nelle tre popolazioni interessate dalle analisi parassitologiche (Awajun, Ashaninka e Shipibo), è stata accertata un’elevata prevalenza di enteroparassiti: 35-43% per i nematodi, 35- 61% per i protozoi e 3-29% per Hymenolepis nana (l'unico platyhelminto riscontraro). I parassiti contenenti chitina più frequenti nella popolazione campione erano i protozoi Giardia lamblia, Entamoeba histolitica, e i macro-parassiti Ancylostoma/Necator, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichiuris trichura e Hymenolepis nana. Diversamente, la popolazione di controllo di peruviani urbanizzati presenta abitudini alimentari occidentalizzate e una bassa prevalenza di elminti intestinali (2-12%). L'analisi comparativa della distribuzione di enteroparassiti in popolazioni umane ha dimostrato che gli Amerindi sono esposti a una gamma ridotta di elminti contenenti chitina, e che le specie istozoiche più severe (trematodi, Taenia e filarie) sono assenti in popolazioni dell’Amazzonia peruviana (Ibanez et al., 2004), e nalla banca dati on-line GIDEON. La duplicazione 24 bp che causa la deficienza enzimatica in Chitotriosidasi risultata altamente conservata, con una frequenza di 47.06% negli Amerindi, e 27,55% nei peruviani. Questa frequenza è la seconda più alta al mondo, dopo la popolazione cinese Han (Choi et al., 2001). Le frequenze genotipiche rispettano l’Equilibrio di Hardy Weinberg nelle singole popolazioni, nella popolazione totale (X ² = 0.006, p = 0,939), escludendo la presenza di pressione selettiva per questo allele. Nel gruppo di controllo è stato riscontrato il maggior discostamento dai valori attesi (p = 0,091; significativo con p < 0,05). L’esone 4 di CHIA codifica il dominio catalitico: 3 SNP (A290G, G296A, G339T) sono noti per ridurre l’attività enzimatica a differenti pH. L' aplotipo "AGG", wild-type (WT) negli umani, è conservato anche negli Amerindiani peruviani con una frequenza del 96 % e un alto grado di omologia e omozigosi. Dalla sequenza WT negli Amerindi, sono emerse numerose sostituzioni in loci molto variabili nelle popolazioni umane. In base al confronto con l’allele ancestrale, alla distribuzione delle frequenze alleliche e l’Fst per coppie di polazioni, numerosi polimorfismi a livello del promotore e 5’UTR, e tre varianti non-sinonime (rs2275253, esone 10; re2275254, esone 11; rs2256721, esone 12), risultano fissate nelle popolazioni amerindiane. Discussione Gli studi etnobiologico e parassitologico hanno accertato uno stile di vita tradizionale, fortemente influenzato da fattori ambientali e, in particolare, da un’elevata prevalenza di macroparassiti contenenti chitina e da un intenso consumo di invertebrati selvatici. Tuttavia gli amerindi non conoscono numerose specie di parassiti istozoici: trematodi (Schistosoma e Fasciola), Taenia, e delle filarie, che non sono enteroparassiti, hanno cicli biologici complessi e possono produrre granulomi e fibrosi in diversi organi (fegato, cervello, sistema linfatico, muscoli) (Jackson et al., 2009; Anthony et al, 2007). Anche se i dati raccolti non permettono di realizzare analisi di correlazione tra genotipi e infezioni parassitarie, la deficienza enzimatica di Chitotriosidasi è assolutamente elevata e maggiore rispetto alla popolazione peruviana. Possiamo quindi dedurre che gli enteroparassiti riscontrati non esercitino pressione selettiva in favore di una Chitotriosidasi funzionale, nel nostro campione. Possiamo anche escludere che la Chitotriosidasi funzionale (WT freq.: 72,45%) sià più frequente nella popolazione di controllo in risposta agli enteroparassiti, che sono meno frequenti in aree urbane. Più probabilmente, la migrazione di Europei e Africani dopo la conquista può aver determinato alte frequenze del allele WT nei peruviani non-etnici e in altri paesi centro e sud americani come Messico (76%)(Juárez-Rendón et al., 2012) e Brasile (74%)(Adelino et al., 2010). Questa "mutazione" è assente nei primati e in molte popolazioni africane (Benin: 0%; Burkina Faso: 0,2%) (Piras et al., 2007), mentre mostra le frequenze più alte nelle popolazioni asiatiche: Cinese Han (58%) (Chien et al, 2005); India 40% (Choi et al., 2001), suggerendo che questa variante sia emersa dopo la migrazione dell’uomo dal continente africano (Piras et al., 2007). Consideranto che i primi abitanti del Nuovo Mondo provennero da popolazioni dell'estremo est-asiatico tra 6 e 30 anni fa, è plausibile che le alte frequenze della mutazione (>40%) siano dovute all’effetto del fondatore, e potrebbero dunque essere conservate in tutte le popolazioni indigene del Sud America. Il gene CHIA (esoni e promotore 1000 bp dal 5’UTR) presentano un aplotipo specifico, con molti loci che presentano alta frequenza dell'allele derivato (95%), raro negli Africani e negli Europei (<30%), quindi candidati come loci interessati da pressione selettiva. Tali varianti sono localizzate nella regione del promotore e negli ultimi tre esoni (10, 11 e 12), influenzando la funzionalità del sito de legame. E’ rilevante notare che le tre varianti non-sinonime sono associate a fenotipi asmatici Th2 in Centroamericani ed Europei, suggerendo ulteriori legami tra la co-evoluzione uomo-elminti, la funzionalità di AMCase e disordini immunologici. Si può pertanto ipotizzare che negli Amerindiani sia avvenuta una riqualificazione funzionale che coinvolge l'espressione genica e il sito di legame. Solo il polimorfismo re2275254 (T1218C, Phe354Ser), esone 11, ha alte frequenze dell'allele ancestrale sia in Africa tropicale che in Sud America, e frequenze più basse nelle regioni temperate di Asia ed Europa, che è un cline rilevante di distribuzione geografica per un allele funzionale (Coop et al., 2009), associato alla variazione latitudinale dei principali fattori ambientali, che influenzano la distribuzione dei parassiti.

Binomio Chitina-Chitinasi in popolazioni indigene andino-amazzoniche del Perù / Manno, Nicola. - (2013 Dec 02).

Binomio Chitina-Chitinasi in popolazioni indigene andino-amazzoniche del Perù

Manno, Nicola
2013

Abstract

La chitina è un polisaccaride-azotato insolubile presente in strutture di patogeni dell’Uomo e in alimenti come artropodi e funghi (Muzzarelli et al., 2011). Gli esseri umani hanno due chitinasi enzimaticamente attive, codificate da due geni paraloghi: Chitotriosidasi (CHIT, gene CHIT1) e Acidic Mammalian Chitinase (AMCase, gene CHIA). CHIT ha massima attività enzimatica a pH 6, si esprime nei macrofagi, ed è sovra-espressa durante infezione malarica, pertanto prende parte alla risposta immunitaria innata (Musumeci et al., 2005). È interessante notare che la deficienza enzimatica di CHIT1 (dovuta ad una duplicazione di 24 bp sull’esone 10 di CHIT1) è frequente in molte popolazioni umane, e assente negli altri primati (Gianfrancesco & Musumeci, 2004), suggerendo che la funzione chitinolitica, per questa chitinasi, potrebbe essere ridondante nell’uomo (Piras et al., 2007). AMCase è espressa prevalentemente in cellule epiteliali, e sovra-espressa in macrofagi specializzati attivati durante risposte immunitarie umorali Th2 (T-helper di tipo 2) a infezioni da elminti parassiti e durante risposte asmatiche a particelle di chitina, suggerendo che AMCase mantiene la funzione immunologica e prende parte a disturbi del sistema immunitario come atopie ed asma (Reese et al., 2007). AMCase si esprime anche nello stomaco, ma non nel duodeno e nell'intestino (Boot et al, 2005). Infine, esercita attività enzimatica a pH 2 , 4.6 e 7, caratteristici di stomaco, lisosomi e polmoni, rispettivamente (Seibold et al, 2009), difatti le secrezioni gastriche umane esercitano attività chitinolitica dovuta a AMCase (Paoletti et al, 2007; Cozzarini et al, 2009). Obbiettivi Studiare il binomio chitina-chitinasi in comunità native dell’Amazonia e Ande del Perú, che vivono in condizioni di elevata esposizione a chitina ambientale, rispetto a un gruppo controllo di popolazione urbanizzata. Descrivere due dei principali fattori di esposizione alla chitina: la dieta e gli elminti. Con un approccio evoluzionistico e il supporto di differenti strumenti bioinformatici, verranno discusse le possibili correlazioni tra la variabilità genetica delle chitinasi e la diffusione di parassiti intestinali e distubi associati alle chitinasi, nelle popolazioni mondiali. Metodi Studio etnobiologico descrittivo della dieta tradizionale, soprattutto di insetti e crostacei. Analisi copro-parassitologica per individuazione e determinazione di uova/oocisti/larve in 76 amerindi di origine Awajun, Ashaninka e Shipibo. Analisi statistica di similarità–distanza tra gli Amerindi e casi studio in diverse popolazioni mondiali, in base alla prevalenza di parassiti contenenti chitina (database GIDEON). Genotipizzazione della duplicazione CHIT1 mediante sequenziamento e elettroforesi, in 85 Amerindi e 50 controlli urbanizzati. Sequenziamento del promotore e esone 4 di CHIA (75 Amerindi, e 39 controlli, rispettivemente). Restrizione enzimatica per genetipizzare la variante nota sull’esone 12, in parte del campione. Studio della variabilitá del gene CHIA in 14 popolazioni (database ENSEMBL). Risultati I dati etnobiologici hanno confermato, in Awajún, Ashaninka, Quechua-Lamas, una alimentazione basata sulla biodiversità selvatica, tra cui il consumo giornaliero di insetti, crostacei e funghi; gli Shipibo che vivono a Lima hanno confermato abitudini alimentari tradizionali e consumo di artropodi prima di migrare; i Quechua del Cusco (3000-4000 mslm), consumano saltuariamente larve di coleottero e bruchi. Nelle tre popolazioni interessate dalle analisi parassitologiche (Awajun, Ashaninka e Shipibo), è stata accertata un’elevata prevalenza di enteroparassiti: 35-43% per i nematodi, 35- 61% per i protozoi e 3-29% per Hymenolepis nana (l'unico platyhelminto riscontraro). I parassiti contenenti chitina più frequenti nella popolazione campione erano i protozoi Giardia lamblia, Entamoeba histolitica, e i macro-parassiti Ancylostoma/Necator, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichiuris trichura e Hymenolepis nana. Diversamente, la popolazione di controllo di peruviani urbanizzati presenta abitudini alimentari occidentalizzate e una bassa prevalenza di elminti intestinali (2-12%). L'analisi comparativa della distribuzione di enteroparassiti in popolazioni umane ha dimostrato che gli Amerindi sono esposti a una gamma ridotta di elminti contenenti chitina, e che le specie istozoiche più severe (trematodi, Taenia e filarie) sono assenti in popolazioni dell’Amazzonia peruviana (Ibanez et al., 2004), e nalla banca dati on-line GIDEON. La duplicazione 24 bp che causa la deficienza enzimatica in Chitotriosidasi risultata altamente conservata, con una frequenza di 47.06% negli Amerindi, e 27,55% nei peruviani. Questa frequenza è la seconda più alta al mondo, dopo la popolazione cinese Han (Choi et al., 2001). Le frequenze genotipiche rispettano l’Equilibrio di Hardy Weinberg nelle singole popolazioni, nella popolazione totale (X ² = 0.006, p = 0,939), escludendo la presenza di pressione selettiva per questo allele. Nel gruppo di controllo è stato riscontrato il maggior discostamento dai valori attesi (p = 0,091; significativo con p < 0,05). L’esone 4 di CHIA codifica il dominio catalitico: 3 SNP (A290G, G296A, G339T) sono noti per ridurre l’attività enzimatica a differenti pH. L' aplotipo "AGG", wild-type (WT) negli umani, è conservato anche negli Amerindiani peruviani con una frequenza del 96 % e un alto grado di omologia e omozigosi. Dalla sequenza WT negli Amerindi, sono emerse numerose sostituzioni in loci molto variabili nelle popolazioni umane. In base al confronto con l’allele ancestrale, alla distribuzione delle frequenze alleliche e l’Fst per coppie di polazioni, numerosi polimorfismi a livello del promotore e 5’UTR, e tre varianti non-sinonime (rs2275253, esone 10; re2275254, esone 11; rs2256721, esone 12), risultano fissate nelle popolazioni amerindiane. Discussione Gli studi etnobiologico e parassitologico hanno accertato uno stile di vita tradizionale, fortemente influenzato da fattori ambientali e, in particolare, da un’elevata prevalenza di macroparassiti contenenti chitina e da un intenso consumo di invertebrati selvatici. Tuttavia gli amerindi non conoscono numerose specie di parassiti istozoici: trematodi (Schistosoma e Fasciola), Taenia, e delle filarie, che non sono enteroparassiti, hanno cicli biologici complessi e possono produrre granulomi e fibrosi in diversi organi (fegato, cervello, sistema linfatico, muscoli) (Jackson et al., 2009; Anthony et al, 2007). Anche se i dati raccolti non permettono di realizzare analisi di correlazione tra genotipi e infezioni parassitarie, la deficienza enzimatica di Chitotriosidasi è assolutamente elevata e maggiore rispetto alla popolazione peruviana. Possiamo quindi dedurre che gli enteroparassiti riscontrati non esercitino pressione selettiva in favore di una Chitotriosidasi funzionale, nel nostro campione. Possiamo anche escludere che la Chitotriosidasi funzionale (WT freq.: 72,45%) sià più frequente nella popolazione di controllo in risposta agli enteroparassiti, che sono meno frequenti in aree urbane. Più probabilmente, la migrazione di Europei e Africani dopo la conquista può aver determinato alte frequenze del allele WT nei peruviani non-etnici e in altri paesi centro e sud americani come Messico (76%)(Juárez-Rendón et al., 2012) e Brasile (74%)(Adelino et al., 2010). Questa "mutazione" è assente nei primati e in molte popolazioni africane (Benin: 0%; Burkina Faso: 0,2%) (Piras et al., 2007), mentre mostra le frequenze più alte nelle popolazioni asiatiche: Cinese Han (58%) (Chien et al, 2005); India 40% (Choi et al., 2001), suggerendo che questa variante sia emersa dopo la migrazione dell’uomo dal continente africano (Piras et al., 2007). Consideranto che i primi abitanti del Nuovo Mondo provennero da popolazioni dell'estremo est-asiatico tra 6 e 30 anni fa, è plausibile che le alte frequenze della mutazione (>40%) siano dovute all’effetto del fondatore, e potrebbero dunque essere conservate in tutte le popolazioni indigene del Sud America. Il gene CHIA (esoni e promotore 1000 bp dal 5’UTR) presentano un aplotipo specifico, con molti loci che presentano alta frequenza dell'allele derivato (95%), raro negli Africani e negli Europei (<30%), quindi candidati come loci interessati da pressione selettiva. Tali varianti sono localizzate nella regione del promotore e negli ultimi tre esoni (10, 11 e 12), influenzando la funzionalità del sito de legame. E’ rilevante notare che le tre varianti non-sinonime sono associate a fenotipi asmatici Th2 in Centroamericani ed Europei, suggerendo ulteriori legami tra la co-evoluzione uomo-elminti, la funzionalità di AMCase e disordini immunologici. Si può pertanto ipotizzare che negli Amerindiani sia avvenuta una riqualificazione funzionale che coinvolge l'espressione genica e il sito di legame. Solo il polimorfismo re2275254 (T1218C, Phe354Ser), esone 11, ha alte frequenze dell'allele ancestrale sia in Africa tropicale che in Sud America, e frequenze più basse nelle regioni temperate di Asia ed Europa, che è un cline rilevante di distribuzione geografica per un allele funzionale (Coop et al., 2009), associato alla variazione latitudinale dei principali fattori ambientali, che influenzano la distribuzione dei parassiti.
2-dic-2013
Chitin is the second most abundant structural biopolymer, present in human pathogens and in human foods, such as arthropods and fungi (Muzzarelli et al., 2012). Humans have two enzymatically active Chitinases, coded by 2 paralogous genes: Chitotriosidase (CHIT, gene CHIT1) and Acidic Mammalian Chitinase (AMCase, gene CHIA). CHIT has an optimum pH of 6 and is expressed in macrophages and found prestored in neutrophil granules, and over-expressed during malaria infection, so takes part to innate immunity (Musumeci & Paoletti, 2009). Interestingly, the enzymatic deficiency of CHIT (due to a 24-bp duplication on CHIT1 exon 10, named Allele H) is frequent in many human populations (Gianfrancesco & Musumeci, 2004), suggesting that chitinolytic function could be redundant for this Chitinase (Piras et al., 2007). AMCase is expressed mainly in epithelial cells, and over-expressed in alternatively activated macrophages, during Th2 (T-helper type 2) humoral responses to helminth parasites and during asthmatic responses to chitin particles, suggesting that AMCase maintains the immunologic function and take part to immune disorders (Reese et al., 2007). AMCase is also expressed in stomach, but not in duodenum and gut (Boot et al., 2005), and showed chitinolytic activity in human gastric secretions (Paoletti et al., 2007). Indeed, this enzyme exerts enzymatic activity at different pH levels: pH 2, 4.6 and 7, characteristic of stomach, lysosomes and lung respectively (Seibold et al., 2009). Three non-synonymous SNPs on CHIA exon 4 are known to cause three amino-acidic changes in proximity of the catalytic-domain, so to directly influence the pH specificity of the isoforms (Olland et al., 2009). This PhD study investigates Chitinase functional variants in 5 Amerindian populations of Peruvian Amazon and Andes, respect to the main environmental factors of chitin exposure: the indigenous diet, specifically the consumption of arthropods, and intestinal parasites. Methods Ethnobiological descriptive study of the traditional diet, especially insects and crustaceans. Copro-parasitological analysis, for eggs/oocysts/larvas detection and determination, of 76 Amerindians from 3 communities of Awajún, Ashaninka and Shipibo peoples. Difference-similarity statistical analysis between Peruvian Amerindians and world-wide human populations, based on the distribution of chitincontaining parasites (GIDEON database). Genotyping of CHIT1 duplication by sequencing and electrophoresis, from 85 Amerindians and 50 urbanized controls, see Piras (2007). To sequence CHIA gene in 9 Amerindians, and promoter region and exon 4 in a sample of 75 Amerindians and 29- 39 controls, respectively. Enzymatic restriction for the detection of the known variant on exon 12. Analysis of human diversity of CHIA gene based on 14 populations (ENSEMBL database). Results Chitin exposure was assessed in relation to the main environmental factors: arthropods-based diet (species) and high enteroparasites’ prevalence. Ethnobiological data confirmed traditional dietary habits: in Awajún, Ashaninka, Quechua-Lamas was observed an alimentation based on wild biodiversity, including daily consumption of insects, crustaceans and fungi. Also Shipibo people confirmed inset consumption and other traditional dietary habits before migrating to Lima. In the three populations interested by parasitological analysis was assessed a high prevalence of enteroparasites: 35-43% for nematodes, 35-61% for protozoans and 3-29% for Hymenolepis nana. The main chitin-containing parasites found in this sample population were the protozoan Giardia lamblia, Entamoeba histolitica; and the macroparasites Ancylostoma/Necator, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichiuris trichura and Hymenolepis nana. Differently, westernized food habits and lower parasite prevalence (2-12%) characterize the control population of urbanized Peruvians. The comparative analysis of enteroparasites’ distribution in human populations showed that Amerindians are exposed to a reduced pattern of chitin containing macro-parasites, and the most severe ones (trematodes and filarial nematodes) are absent in rural andean-amazonic Peru, as confirmed in other studies conducted in Peruvian Amazon (Ibanez et al., 2004; GIDEON database). The 24-bp duplication causing catalytic deficiency resulted highly conserved, with a frequency of 47.06% in the whole Amerindian sample, and 27.55% in Peruvian controls. This frequency rate is the second highest worldwide, after Chinese Han population (Choi et al., 2001; Piras et al., 2007). Genotypic frequencies were consistent with the Hardy Weinberg Equilibrium, within each indigenous population and in total Amerindians (X²= 0.006; p = 0.939), excluding the presence of selective pressure on this allele. Peruvian control population has the highest, even not significant, deviation from expected values (p = 0.091). CHIA exon 4 encodes for the catalytic domain of Acidic Mammalian Chitinase, and 3 SNPs (A290G, G296A, G339T) are known to determine pH optimum of enzymatic activity. The “AGG” haplotype, wild-type in Humans, is conserved in Peruvian Amerindians, with a frequency of 96% and a high degree of homology and homozygosis within and among the five populations. Is known that this isoform maintains the enzymatic activity at lysosomes’ pH of 4.6, but at stomach pH (2), and lung pH (7), it is respectively reduced and ablated (Seibold et al., 2009). From the analysis of the entire gene sequence, by considering the allelic frequency distribution and Fst between pairs of populations, emerged several relevant polymorphisms, rare in humans and fixed in Amerindians. Variants rs12023321, rs35042265, rs4554721, rs4442363, rs11102235, rs34698010, rs12026825, rs2275253 (exon 10), rs2256721 (exon 12), presenting high frequencies of the derived allele (93-95%), and rs12033184, rs4546919, re2275254 (exon 11), presenting the ancestral allele. Discussion Both ethnobiological and parasitological studies gave evidences of a conserved traditional lifestyle, strongly influenced by environmental factors and, specifically, by high exposure to chitin-containing parasites (especially helminths) and unconventional foods, including chitinous invertebrates. However parasite diversity showed that Amerindians do not suffer parasitoses from histozoic species like trematods (Schistosoma and Fasciola), Taenia sp., and filarial nematodes, that have complex lifecycles inducing granulomas and fibrosis in different human organs (liver, brain, lymphatic system etc.) (Jackson et al., 2009; Anthony et al., 2007). Even if no correlation analysis between Chitinases’ genotype and parasite infection is possible with present data, Chitotriosidase inactive variant is absolutely high and higher respect to controls, thus we can deduce that the reduced pattern of chitin-containing enteroparasites isn’t acting any selective pressure for the functional Chitotriosidase, in our sample. We can also exclude that the functional variant is conserved in control population (WT freq: 73%) because of enteroparasites’ pressure, which are scarce in urban areas. Rather, mixing with Europeans and Africans during last centuries may have determined high WT frequencies in non-ethnic Peruvians. The inactive variant is absent in non-human primates, and in most African populations, and Asiatic populations - Chinese Han (58%) (Chien et al., 2005) y India (40%) (Choi et al., 2001) – have the highest frequencies, suggesting that this “mutation” occurred after human migration out of Africa (Piras et al., 2007). Considering that first inhabitants of New World descend from eastern-Asia populations, is it plausible that the duplication is highly conserved for a founder effect in all South American Amerindians. The CHIA coding sequence and promoter present a specific haplotype, with many loci with high frequency of the derived allele (93-96%), most rare in Africans and Europeans (<30%), so candidates for positive selection. Such variants are localized in promoter region and in the last three exons (10, 11 and 12), coding for the chitinbinding domain, therefore a functional reorganization involving gene expression and chitin-binding site is probable in South Amerindians. Intriguingly, these three nonsynonymous variants are associated with Th2 asthmatic phenotypes in Central Americans and Europeans, suggesting further links between man-helminths coevolution, AMCase functionality and immunologic disorders (Anthony et al., 2007). Only the polymorphism re2275254 (T1218C, Phe354Ser), on exon 11, presented high frequencies of the ancestral allele in tropical Africa and South America, and lower frequencies in temperate regions of Asia and Europe. This is a relevant feature of geographic distribution for functional alleles (Coop et al., 2009), evidently associated to the latitudinal variation of parasites’ distribution.
chitina, chitinasi umane, Perù, Awajun, Ashaninka, Shipibo, Quechua, Lamas, insetti commestibili, macroparassiti intestinali, genotipo, varianti funzionali, ipotesi dell'igiene
Binomio Chitina-Chitinasi in popolazioni indigene andino-amazzoniche del Perù / Manno, Nicola. - (2013 Dec 02).
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