Investigating the role of Emilin3, an extracellular matrix protein of the Emilin/Multimerin family

Emilin3 is an extracellular matrix molecule belonging to the EMILIN/Multimerin family. Emilin1, the founding member of this family, was originally identified as a glycoprotein particularly abundant in blood vessels, where it was found to be associated with elastic fibers. Whether Emilin3 is also associated with elastic fibers is still unknown. Differently from Emilin1 and all the other members of the family, Emilin3 is not expressed in the cardiovascular system, as shown by our studies both in mouse and zebrafish. The main focus of my PhD study was to elucidate the function of Emilin3 during embryonic development, using zebrafish as a model. The two zebrafish Emilin3 paralog genes, emilin3a and emilin3b, are dynamically expressed in the tail bud, in the chordoneural hinge, and in the notochord during early zebrafish development. By using a novel specific antibody, I found that Emilin3 is deposited in the notochord sheath, a specialized extracellular matrix structure that surrounds the notochord. Morpholino-mediated knockdown of both Emilin3 paralogs led to a marked distortion of the notochord, as a consequence of structural defects of the notochord sheath. Besides its structural role, the notochord has also an important patterning activity, a process that is mainly mediated by the secretion of Hedgehog (Hh) ligands. Notably, the patterning activity of the notochord is also affected by Emilin3, as revealed by increased Hh signaling in Emilin3 depleted embryos and decreased Hh signaling in embryos overexpressing Emilin3 in notochord cells. Mechanistically, in vitro and in vivo experiments showed that Emilin3 modulates the availability of Hh ligands by interacting with the permissive factor Scube2. Altogether, these findings indicate that Emilin3 has an essential role for the proper structure and function of the developing notochord. During my PhD, I also investigated the distribution pattern of Emilin3 in mouse tissues. Taking advantage of specific antibodies, I investigated and compared the distribution of different Emilin proteins in mouse tissues. The data show that, similarly to what I observed in zebrafish, Emilin3 has the most restricted tissue distribution. The elucidation of Emilin3 distribution in embryonic and adult tissues was also crucial for starting, during the very last part of my PhD, the phenotypic characterization of Emilin3 knockout mice, which were previously generated in our lab. I found that Emilin3 knockout mice display a decreased body weight gain and an increased mortality during the first four weeks after birth. Microscope analysis revealed strong structural abnormalities of hair follicles within the first catagen/telogen transition. These findings point at a role for Emilin3 in hair follicle maturation, and are the basis for future studies aimed at the full understanding of the role of Emilin3 in embryonic and postnatal development and in tissue homeostasis

Emilina3 è una proteina della matrice extracellulare appartenente alla famiglia delle Emiline/Multimerine. Emilina1, il membro fondatore della famiglia, è abbondantemente espressa nei vasi sanguigni, in associazione alle fibre elastiche. Al contrario, non è ancora noto se Emilina3 sia anch’essa associata a queste strutture. Inoltre, diversamente da Emilina1 e da tutti gli altri membri della famiglia, Emilina3 non è presente nel sistema cardiovascolare, come dimostrato dai nostri studi effettuati sia nel modello murino che in zebrafish. L'obiettivo principale del mio percorso di dottorato è stato quello di chiarire la funzione di Emilina3 durante lo sviluppo embrionale di zebrafish. Durante le prime fasi di vita, i due geni paraloghi di Emilina3, emilin3a ed emilin3b, sono fortemente espressi nella parte posteriore del tronco, in particolare dalle cellule della cerniera cordo-neurale e della notocorda. Dalle 48 ore dopo la fecondazione, l’espressione a livello della notocorda si riduce fino a scomparire e i due trascritti iniziano ad essere espressi a livello degli elementi cartilaginei cranio-facciali in via di sviluppo. L’utilizzo di un anticorpo che riconosce specificatamente Emilina3 di zebrafish mi ha permesso di dimostrare che questa glicoproteina viene depositata nella membrana basale della notocorda, una struttura composta da diverse proteine della matrice extracellulare e che circonda le cellule della notocorda. Tramite la messa a punto di una strategia di knockdown, che prevede l’iniezione di oligonucleotidi morfolino diretti contro entrambi i geni paraloghi di Emilina3, si è osservata una significativa e macroscopica distorsione della notocorda, in seguito allo sviluppo di difetti strutturali della membrana basale della stessa. Oltre al suo ruolo strutturale, la notocorda ha anche un’importante attività di signaling, processo mediato pricipalmente dalla secrezione dei ligandi della via di segnale di Hedgehog (Hh). I dati da me ottenuti in questo lavoro di tesi dimostrano che Emilina3 è in grado di modulare l'attività di segnalazione della notocorda, come si evince dall’aumento dell’attività della via di segnale di Hh in embrioni privi di Emilina3. Viceversa, embrioni che sovraesprimono Emilina3 murina nelle cellule della notocorda mostrano una ridotta attività della via di segnale di Hh. Esperimenti in vivo ed in vitro hanno rivelato che Emilina3 è in grado di modulare la disponibilità dei ligandi di Hh tramite l’interazione con Scube2, un fattore secreto con funzioni permissive nel regolare l’attività di Hh. Complessivamente, questi risultati indicano che Emilina3 ha un ruolo essenziale per il mantenimento della corretta struttura e funzione della notocorda. Durante il mio percorso di dottorato, ho anche analizzato la distribuzione di Emilina3 nei tessuti di topo adulto, confrontandola con quella di Emilina1. I dati mostrano che Emilina3 ha una distribuzione tessutale più ristretta rispetto a quanto osservato per Emilina1. Queste analisi di localizzazione sono state fondamentali anche per l'avvio, durante l'ultima parte del mio dottorato di ricerca, della caratterizzazione fenotipica di topi knockout privi di Emilina3, precedentemente generati nel laboratorio del Prof. Paolo Bonaldo. I dati da me ottenuti dimostrano che l’assenza di Emilina3 porta ad una riduzione del peso corporeo e ad un aumento della mortalità dei topi Emilin3 knockout durante le prime quattro settimane di vita. Le successive analisi istologiche hanno rivelato marcate alterazioni nei follicoli piliferi, in particolare durante la prima transizione tra le fasi di regressione (catagen) e quiescenza (telogen) del follicolo pilifero. Questi risultati ottenuti nei topi Emilin3 knockout rappresentano una base importante per futuri studi volti a comprendere in dettaglio la funzione di Emilina3 nella regolazione dell'omeostasi tissutale nei mammiferi