Studio dell'€™attività biologica della proteina ORF-A del virus dell'€™immunodeficienza felina

Feline Immunodeficiency Virus (FIV), a non-primate lentivirus, causes an immunodeficiency syndrome in domestic cats that is strikingly similar to AIDS in humans. Although diverse in term of evolution, FIV is similar to Human Immunodeficiency Virus Type-1 (HIV-1) in many respects including genome organization, target cells infected in vivo, course of infection and disease state. Thus, for these reasons, FIV represents an attractive model for AIDS research. Similarly to HIV-1 and other lentivirus, the FIV genome encodes three large open reading frame gag, pol, env that encode for the structural and enzymatic proteins. HIV-1 encodes six additional small open reading frames that express regulatory and accessory proteins: vif, rev, tat, vpr, vpu and nef. However, the FIV genome contains only three additional open reading frames, two of which include rev, that encodes a viral post transcriptional regulatory protein and vif that encodes an accessory protein necessary for viral infectivity. The primary function of the third gene designated orf-A remains unclear but it is believed to represent a multifunctional accessory protein similar to HIV-1 Vpr, Tat and Nef accessory proteins. This study is part of a research project aimed to clarify FIV biology, focusing on the functions performed by ORF-A. Firstly, we evaluated Orf-A expression and its involvement in the cell cycle progression using different systems of over-expression. Secondly, in order to explore Orf-A involvement in cell cycle progression in the context of more physiological conditions, we obtained Petaluma proviral constructs containing a tagged version of Orf-A. Moreover, we employed the same constructs in order to evaluate i) the intracellular localization of Orf-A and Cyclin B1 proteins with immunofluorescence assays; ii) the replicative capacity of Orf-A tagged plus and minus viruses; iii) the incorporation of the Orf-A protein in viral particles. Taken together, the results suggest that Orf-A expression leads to a cell cycle arrest in G2/M phase, indicating a role of Orf-A similar to the one described for HIV-1 Vpr. Furthermore, for the first time we report the Orf-A incorporation into viral particles. This study contributes to dissect FIV Orf-A functions and to clarify the mechanisms underlying Feline Immunodeficiency Virus and, generally, lentiviruses biology

Il Virus dell'™Immunodeficienza Felina (FIV) è un Lentivirus dei non primati che causa nel gatto domestico una sindrome cronica progressiva molto simile alla Sindrome da Immunodeficienza Acquisita (AIDS) generata dal Virus dell'™Immunodeficienza Umana di tipo 1 (HIV-1). Le analogie tra FIV ed HIV-1 coinvolgono numerosi aspetti, tra cui l'™organizzazione genomica, il ciclo replicativo, i bersagli cellulari ed i meccanismi patogenetici. Per questi motivi FIV ed il suo ospite naturale rappresentano un interessante modello per la ricerca sull'AIDS. Similmente ad HIV-1, il genoma di FIV contiene i geni gag, pol, env che codificano le proteine strutturali ed enzimatiche del virione e i geni accessori e regolatori che giocano un ruolo chiave nella regolazione e nell'™infettività virale. A differenza del genoma di HIV-1 caratterizzato dalla presenza di quattro geni accessori, il genoma di FIV ne presenta due: vif ed orf-A. Di questi, il primo codifica il fattore di infettività virale, molto simile a quello di HIV-1, mentre il secondo gene codifica la proteina Orf-A. Il ruolo biologico di Orf-A non è stato ancora chiarito, ma si ritiene rappresenti una proteina accessoria multifunzionale con caratteristiche simili alle proteine accessorie di HIV-1 quali Vpr, Tat e Nef. Il presente lavoro di dottorato si inserisce in un progetto di ricerca più ampio, volto a chiarire la biologia di base di FIV, focalizzandosi sulle funzioni svolte dalla proteina Orf-A. Inizialmente è stata valutata l'™espressione della proteina ed il suo coinvolgimento nel ciclo cellulare mediante diversi sistemi di over-espressione. Successivamente sono stati condotti gli stessi esperimenti in un contesto più simile a quello fisiologico. Pertanto, sono stati ottenuti plasmidi basati sul genoma provirale, Orf-A plus e minus, dove l'™estremità Carbossi-terminale della proteina Orf-A è stata fusa al tag HA. I vettori sono stati testati sia in cellule umane che feline per valutarne l'™espressione ed il coinvolgimento nella progressione del ciclo cellulare. Gli stessi plasmidi sono stati impiegati per valutare i) la localizzazione della proteina Orf-A e della Ciclina B1 target del blocco del ciclo cellulare in saggi di immunofluorescenza; ii) la capacità replicativa del virus; iii) l'™incorporazione della proteina Orf-A nelle particelle virali. Nel complesso, i risultati suggeriscono che, laddove la proteina Orf-A è espressa, si verifica un arresto del ciclo cellulare in fase G2/M indicando un ruolo di Orf-A simile a quello descritto per la proteina Vpr di HIV-1. Inoltre, per la prima volta in letteratura, è stata dimostrata l'™incorporazione della proteina Orf-A nelle particelle virali. Questo studio contribuisce a dissezionare le funzioni della proteina Orf-A di FIV ed a chiarire i meccanismi alla base della biologia del Virus dell'™Immunodeficienza Felina e, più in generale, di quella dei lentivirus