Role of metal ions dyshomeostasis in neurodegeneration

In the present study metal ions role in neurodegenerative processes has been investigated. Two major pathways have been developed: 1) metal ions role in β-amyloid (Aβ folding and deposition from in vitro to in vivo; 2) calcium dyshomeostasis in an in vitro model of neurodegeneration. Firstly, metal ions role (aluminum, copper, iron, zinc) in Aβ folding and deposition was assessed. Aβ misfolding is, in fact, believed to play a critical role in Alzheimer’s disease pathogenesis. Our data confirm that Aβ folding is closely related to the conjugated metal ion, thereby following peculiar metal ion-dependent conformational changes. Strikingly, we report that aluminum, a non physiological metal ion, is the most efficient in “freezing” Aβ in its oligomeric and most toxic state. Within this framework we investigated the mechanisms underlying Aβ and Aβ-metal conjugates toxicity. To that aim we employed two natural compounds (resveratrol and cholesterol) acting on two different Aβ mechanisms of toxicity: oxidative stress and membrane damage, respectively. In both cases, in vitro analysis revealed that resveratrol and cholesterol do not influence Aβ and Aβ-metal conjugates folding processes, but are still effective in protecting a neuronal-like cell line against Aβ toxicity. We reported that resveratrol was able to significantly reduce the Aβ-triggered generation of reactive oxygen species, meanwhile physiological concentrations of cholesterol were effective in protecting cellular membrane structure against Aβ (especially Aβ-Al) lipid disrupting activity. To further assess that differently shaped Aβ-metal conjugates result in different biological responses, we investigated Aβ-Cu and Aβ-Zn role in influencing/altering gene expression profile in a neuronal-like cell line. We found that these two conjugates are effective in modulating expression of transcripts involved in inflammatory processes, oxidative stress, and in apoptotic cell death. Following these in vitro studies we decided to investigate whether expression of transcripts involved in metal ions homeostasis resulted affected in an in vivo model of the disease, represented by the 3xTg-AD mice. Our data highlight a significant overlapping between the expression profiles of young 3xTg-AD mice compared with aged wild type mice; this finding support the notion that Alzheimer’s disease can be interpreted as a boosted variant of otherwise naturally occurring age-driven changes. In our dataset we found several differentially expressed transcripts involved in calcium homeostasis, a key metal ion for the physiology of the cell. Secondly, calcium dyshomeostasis in striatal neurons following excitotoxic challenge was assessed. Striatal neurons degeneration is involved in several pathologies showing motor and behavioral sequelae, such as Huntington’s disease (HD). We tried to determine why a subpopulation of striatal neurons results spared in HD striata, showing a peculiar resistance towards excitotoxic challenges. Our data demonstrate that the striking resistance of these cells may be due to boosted scavenging capabilities embedded in such neuronal subpopulation, resulting in lack of ROS generation upon excitotoxic insults. Collectively, these findings highlight the pivotal role played by metal ions in the development of neurodegenerative disorders. Noteworthy, not only endogenous and biologically relevant metal ions (iron, copper, zinc and calcium) seem involved in the pathogenesis of neurodegenerative disorders, but also exogenous metals (i.e.: aluminum) could have a key and subtle, although less investigated, role in neuronal degeneration

Il presente lavoro di tesi si è suddiviso in due filoni principali che hanno come filo conduttore la disomeostasi di ioni metallici nei processi neurodegenerativi. La prima parte riporta lo studio sul ruolo di alcuni ioni metallici (alluminio, ferro, rame e zinco) nel processo di folding della proteina β-amiloide (Aβ), ritenuta uno dei fattori eziopatogenici del morbo di Alzheimer. I dati ottenuti dimostrano come i complessi Aβ-metallo-ione acquistino una peculiare conformazione dipendente dal metallo legato, conferendo così all’Aβ particolari proprietà citotossiche. Tale citotossicità risulta particolarmente evidente per il complesso Aβ-Al che è in grado di aumentare, in maniera significativa, la tossicità data dalla sola Aβ o dalla stessa Aβ coniugata con metalli diversi dall’Al. All’interno di questo quadro sperimentale si è poi cercato di indagare più nel dettaglio i meccanismi con i quali Aβ, e i suoi complessi metallici, esercitassero la loro citotossicità. A questo scopo sono stati impiegati due composti quali il resveratrolo e il colesterolo, che vanno ad agire su due meccanismi che stanno alla base della tossicità dell’Aβ, come lo stress ossidativo e l’alterata fluidità delle membrane cellulari. Nel primo caso, i dati in vitro hanno permesso di dimostrare come, agendo in maniera selettiva sulla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) Aβ-mediata, sia possibile ridurre la tossicità di Aβ e dei suoi complessi con metalli redox (rame e ferro) mediante un meccanismo di scavenging dei ROS ad opera del resveratrolo, dalle spiccate proprietà anti-ossidanti e neuro-protettive. A questo punto si è indagata la capacità dei vari complessi Aβ-metalloioni di alterare la struttura di membrane lipidiche attraverso l’uso di modelli di membrane cellulari. In precedenza si era dimostrato come il complesso Aβ-Al fosse l’unico complesso in grado di alterare significativamente la fluidità di layer lipidici. I dati ottenuti ci permettono di affermare che tale capacità è dovuta principalmente alla elevata idrofobicità superficiale del complesso Aβ-Al. Inoltre, agendo sulle membrane cellulari con concentrazioni fisiologiche di colesterolo è stato possibile ridurre l’”irrigidimento” delle membrane (lipidico) conseguente alla presenza di Aβ-Al, e ridurne la citotossicità. Si é quindi approfondito il ruolo geno-tossico dei succitati complessi Aβ-metalloioni andando ad indagare come questi siano in grado di modulare in maniera significativa (e metallo-dipendente) l’espressione genica di numerosi trascritti coinvolti nella patologia di Alzheimer. In particolare, il nostro interesse si è focalizzato sui complessi Aβ-Cu e Aβ-Zn, che si sono rivelati in grado di modulare selettivamente l’espressione di geni coinvolti in processi infiammatori, nello stress ossidativo e nella morte cellulare (apoptosi). Dopo questa serie di studi in vitro si è passati ad indagare l’espressione genica dell’intero genoma umano in un modello in vivo di patologia di Alzheimer. Lo scopo era quello di identificare il network o il pathway d’espressione coinvolti della disomeostasi cationica. I profili d’espressione del modello murino 3xTg-AD sono stati pertanto confrontati con quelli del controllo wild type. In questo contesto, si è scoperta una significativa sovrapposizione dei geni sovra- e sotto-espressi tra topi wild type anziani e topi 3xTg-AD giovani. Questo dato supporta l’idea che il substrato patologico dell’AD possa favorire un processo di invecchiamento precoce. All’interno del gruppo di geni trovati differenzialmente espressi, molti erano coinvolti nell’omeostasi del calcio, ione chiave per la fisiopatologia cellulare. Il secondo filone di ricerca ha riguardato lo studio del ruolo dello ione calcio nell’eccitotossicità dei neuroni dello striato. Tale fenomeno è particolarmente importante in alcune patologie neurodegenerative che hanno come segno caratteristico una progressiva e irreversibile perdita del controllo motorio, come ad esempio il morbo di Huntington. L’interesse si è focalizzato nel determinare il perchè una subpopolazione di neuroni striatali, caratterizzata dalla sovraespressione di nitrico-ossidosintasi, non vada incontro ad apoptosi in seguito a stress eccitotossico. I dati raccolti ci hanno permesso di stabilire che la resistenza di tale sottopopolazione al sovraccarico di calcio è dovuta principalmente ad una potenziata capacità di questi neuroni di detossificarsi rapidamente dalle specie ROS, di origine mitocondriale, specie che si generano durante fenomeni eccitotossici. Conclusione. Nel complesso i dati ottenuti sottolineano una volta di più un ruolo centrale degli ioni metallici nello sviluppo e/o nella progressione di alcune patologie a carattere neurodegenerativo. In particolare è importante notare come, a fianco di alcuni ioni metallici endogeni - che hanno un rilevante ruolo fisiologico (ferro, rame, zinco, calcio) -, anche altri ioni privi (apparentemente) di un ruolo biologico, ma coi quali ci interfacciamo quotidianamente, come ad esempio l’alluminio, sembrino svolgere un ruolo chiave in processi eziopatogenetici legati a fenomeni neurodegenerativi