Malformazioni anorettali: classificazione e studio morfologico ed immunoistochimico della nostra casistica

BACKGROUND The etiology and pathogenesis of anorectal malformations (ARM) are multifactorial, poorly understood and controversial. The classification of ARM from a genetic perspective, it is not easy due to the fact that these malformations exist in various forms probably influenced by different factors such as gender and associated anomalies. In the literature, several chromosomal genetic syndromes have been associated with this malformations; the analysis of associated malformations is an important aspect of the genetic study of ARM, because the association of anomalies with mendelian transmission or with a recognized causative gene can be an essential starting point for further investigations. The normal development of the hindgut depends on the proper development of the cloaca and the cloacal membrane, and epithelial-mesenchymal interactions on the correct essential for proper morphogenesis. Sonic Hedgehog (Shh) is an excellent candidate as a mediator in the interaction between endoderm and mesoderm, multiple studies in animal models have shown that the reduced or non-presence of Shh or its downstream signal mediators, are able to cause defects of different anorectal region. AIM OF THE STUDY The first part of the study is for the most part retrospective, and has the purpose of classifying the genetic point of view and clinical the patients suffering from ARM followed at the Department of Pediatric surgery until the year 2011 (period 1991-2011), dividing them into syndromic forms and not , in isolated or familial cases. Another part of the study aims to identify chromosomal abnormalities associated with ARM. The second part is intended to perform a morphological and immunohistochemical staining of tissue taken from the site of the malformation to verify such alteration parietal are present, and assess the expression of Shh in the context of normal and pathological tissue. MATHERIALS AND METHODS The first retrospective of the project has been obtained by re-evaluating the clinical history of all patients followed at the Department of Pediatric Surgery from 1991 until 2011. To achieve the second objective was performed classical and molecular cytogenetic analysis (by FISH: Fuorescence in situ hybridization or array-CGH: array-based comparative genomic hybridization) of the peripheral blood of patients followed since 2000, with possible extension to their parents or other family members. For the morphological study of the material coming from the site of the malformation, was evaluated by light microscopy and subjected to classical staining hematoxylin-eosin, with the aim to evaluate: the type of coating, the presence of erosion and/or ulceration, edema of the lamina own, the structural architecture of the muscularis layer, the presence of the connective tissue and its disposal. Study of some immunohistochemical markers of muscle differentiation and maturation processes (myogenin), stem cell markers (CD34, CD133,) and the possible pathogenetic pathways involved Shh. RESULTS Were identified in the period 1991-2011, 143 patients divided into 56 isolated forms, 82 associated forms with 6 syndromic forms, 4 clinical associations; 5 cases are not classified. In the male are 50 associated forms and 32 with isolated forms, in the female are 32 associated forms and 24 with the isolated forms. Syndromic forms are found: 2 chromosomal syndromes, 4 genetic syndromes. Was not identified familial form. The most interesting observations of histological study relate to the muscularis evaluated both in its internal and external component: in most of the defects is observed an important disarray of muscle fibers with significant fibrosis. The expression of CD133 was evaluated in the different layers of the intestinal wall and it shows there is an intense expression of this marker but to a lesser extent than the CD34 that presents an intense positivity in all the layers, especially in the lamina propria directly to below the epithelium. The myogenin is constantly negative. Regarding Shh levels of signal strength is considerably lower in the muscularis. CONCLUSIONS The results of this work indicate, in agreement with the literature, that 60% of patients with ARM has a defect associated. Rectovescical fistula in 80% of cases are associated with other malformations, followed by: cloaca (78%), rectourethral fistula (71%), vestibular fistula (65%), perineal fistula (49%). From the reduced expression of Shh in the mesodermal tissue can mean that, or an alteration that affects directly Sonic or its downstream mediators, that causes absence of an optimal gradient parietal necessary for a correct shaping of the intestinal wall layers, and hence the changes in the observed in this preliminary study. This down-regulation may provide a molecular support to the hypothesis that the incomplete formation and division of the cloaca results in a wide variety of malformations of the hindgut. To confirm this hypothesis are still needed further studies on the expression of mediators downstream of the Shh signal such as for example Gli2, Bmp-4, Hox genes and the Wnt protein.

PRESUPPOSTI DELLO STUDIO L’eziopatogenesi delle malformazioni anorettali è sconoscosiuta e multifattoriale. La classificazione delle MAR dal punto di vista genetico non è semplice per il fatto che tali malformazioni si presentano sotto differenti forme influenzate probabilmente, da fattori diversi come il genere e le anomalie associate. Sono descritte in letteratura sindromi genetiche e cromosomiche associate a tali malformazioni e per tale motivo risulta importante conoscere il fenotipo con le quali si manifestano ed eseguire un analisi citogenetica classica nei pazienti con MAR al fine di per poterle individuare anomalie cromosomiche che potrebbero essere associate ad una certa ereditarietà. Il normale sviluppo dell’intestino posteriore (hindgut) dipende dal corretto sviluppo della cloaca e della membrana cloacale, nonché dalle corrette interazioni epitelio-mesenchimali indispensabili per una morfogenesi corretta. Sonic Hedgehog (Shh) è un eccellente candidato come mediatore nelle interazione tra endoderma e mesoderma , multipli studi su modelli animali hanno evidenziato come la ridotta o mancata presenza di Shh o dei mediatori a valle del suo segnale, siano in grado di causare difetti diversi nello sviluppo della regione anorettale. SCOPO La prima parte dello studio è per la maggior parte retrospettivo, ed ha lo scopo di classificare dal punto di vista genetico e clinico, i pazienti affetti da MAR seguiti presso il reparto di chirurgia pediatrica fino all’anno 2011 (periodo 1991-2011), suddividendoli in forme sindromiche e non, in casi sporadici o familiari. Un ulteriore parte dello studio ha lo scopo di identificare anomalie cromosomiali associate alle MAR. La seconda parte ha lo scopo di effettuare una caratterizzazione morfologica e immunoistochimica del tessuto prelevato dal sito della malformazione per verificare quali alterazione parietali siano presenti, e valutare l’espressione di Shh nel contesto del tessuto normale e patologico. MATERIALI E METODI La prima parte del lavoro retrospettivo è stato ottenuto rivalutando la storia clinica di tutti i pazienti seguiti presso il reparto di chirurgia Pediatrica dall’anno 1991 fino al 2011. Per il conseguimento del secondo obiettivo è stata effettuata l’analisi citogenetica classica e molecolare (mediante FISH: Fuorescence in situ Hybridization o con array-CGH: array based-comparative genomic Hybridization), del sangue periferico dei pazienti seguiti dall’anno 2000, con eventuale estensione ai genitori o altri familiari. Per lo studio morfologico il materiale proveniente dalla sede della malformazione, è stato valutato al microscopio ottico e sottoposto alla colorazione classica Ematossilina-Eosina, con lo scopo di valutare: il tipo di rivestimento, presenza di erosione e/o di ulcerazione, edema della lamina propria, l’architettura strutturale della tonaca muscolare, la presenza della trama connettivale e della sua disposizione. Per lo studio immunoistochimico sono stati utilizzati di alcuni marcatori dei processi di maturazione e differenziazione muscolare (Miogenina), dei marcatori di staminalità (CD34, CD133,) e delle possibili vie patogenetiche coinvolte (Shh). RISULTATI Sono stati individuati nel periodo 1991-2011, 143 pazienti affetti da MAR suddivisi in forme isolate 56, forme associate 82, con 6 forme sindromiche , 4 associazioni cliniche; 5 casi non sono classificabili. Nel maschio sono 50 le forme associate e 32 le forme isolate; nella femmina sono 32 le forme associate e 24 le forme isolate. Le forme sindromiche riscontrate sono: 2 sindromi cromosomiche, 4 sindromi genetiche. Non è stata identificata nessuna forma familiare Le osservazioni più interessanti dello studio istologico riguardano la tonaca muscolare valutata sia nella sua componente circolare interna che longitudinale esterna: nella maggior parte dei difetti si osserva un importante disarrangiamento delle fibre muscolari con rilevante dissociazione da parte della componente fibrosa. L’espressione di CD133 è stata valutata nei diversi livelli della parete intestinale; vi è un’intensa espressione di tale marker ma in misura minore rispetto il CD34 che presenta un’intensa positività in tutti gli strati, soprattutto nella lamina propria direttamente al di sotto dell’epitelio. La miogenina è costantemente negativa. Per quanto riguarda Shh i livelli di intensità del segnale è notevolmente più basso nella tonaca muscolare. CONCLUSIONI I risultati di questo lavoro indicano, in accordo con la letteratura, che il 60% dei pazienti con MAR ha un difetto associato. La fistola rettovescicale nel 80% dei casi si associa ad altre malformazioni seguita da: cloaca (78%), fistola rettouretrale (71%), fistola rettovestibolare (65%), fistola perineale (49%). Dalla ridotta espressione di Shh a livello del tessuto mesodermico del difetto si può ipottizare che o, ad un alterazione che colpisce direttamente Sonic o i suoi mediatori a valle, porti all’assenza di un ottimale gradiente parietale necessario per un corretto modellamento degli strati parietali intestinali, e quindi alle alterazioni in parte osservate in questo studio preliminare. Questa down-regulation può fornire una supporto molecolare all’ipotesi che l’incompleta formazione e divisione della cloaca determina un’ampia varietà di malformazioni dell’intestino posteriore. Per confermare tale ipotesi sono comunque necessari ulteriori studi sull’espressione dei mediatori a valle del segnale Shh quali per esempio Gli2, Bmp-4, Hox geni e le proteine Wnt.