Novel polysaccharide anti-tumour drug delivery system for active targeting and controlled release to breast cancer bone metastases

ABSTRACT In the late stage of the disease, breast cancer patients often develop bone metastases, a major cause of cancer-related death among women worldwide. The common treatment currently used clinically includes the anti-neoplastic agent paclitaxel combined with the bisphosphonate alendronate. Paclitaxel is an anti-neoplastic drug which cytotoxic effect is mainly attributed to its ability to promote the assembly of microtubules as well as prevent the depolymerisation of these microtubules. Stabilization of the microtubule networks stops mitotic functions that, in sequence, blocks cell division. Paclitaxel is approved for treatment of ovarian, breast, and non-small cell lung cancers at late stage. However, the anti-tumour drug is highly hydrophobic and consequently is poorly soluble in water. Additionally, the formulation of paclitaxel currently used clinically, known as Taxol, contains the anti-neoplastic drug dissolved in a mixture of Cremophor EL and ethanol in order to increase its solubility. Nevertheless, administration of Cremophor EL results in serious dose-limiting toxicities such as hypersensitivity responses and neuropathy. Furthermore, the chemotherapeutic agent suffers from poor selectivity towards tumours, leading to damage of normal healthy cells. As a result, much effort has been made into the development of novel formulations of paclitaxel using biocompatible and biodegradable polymeric systems. Additionally, bone metastases are of considerable concern for patients with advanced breast cancer. Patients may tackle supplemental challenges to the cancer itself as their skeletal health declines and contributes to a manifest decrease in their quality of life and survival. Several bisphosphonates have been assessed in patients with bone metastases from breast primary tumour, including alendronate, in order to reduce bone resorption and tumour progression. The present project aims at developing a new nano-drug delivery system for site target, and controlled release of anti-tumour drug. The model developed is a polymer-drug conjugate where the anti-tumour drug Paclitaxel and alendronate, are attached to a natural polymeric carrier, Pullulan, through a spacer. The polymer-drug conjugate designed for controlled release under specific physiological conditions uses two main mechanisms for the release, including an enzymatic hydrolysis and non-enzymatic hydrolysis. The choice of spacers between the polymer and the drug was made so that the drug release only occurs once the system reaches the bone metastasis, using an enzymatic hydrolysis first. When polymer-drug conjugates are elaborated for tumour delivery, the linkage between the drug and the polymer must be necessarily stable under physiological conditions until the tumour target is reached. The drug is then cleaved rapidly to be activated. The colloidal carrier was designed to improve the biopharmaceutical and therapeutic properties of the anti tumoural drug paclitaxel, increasing the paclitaxel solubility in water and targeting the tumour itself. The alendronate bisphosphonate was chosen as a targeting agent to confer a high affinity of the conjugate toward the apatite structure of bone metastases by exploiting the strong bone seeking properties of bisphosphonates, together with the micro-environment of bone metastases, in order to ensure a selective release and accumulation of the anti-tumour drug at the desired site of action; the bone metastases. First, preliminary studies investigated the influence of the time of oxidation of pullulan onto its architecture (molecular weight and polydispersivity). Pullulan was modified by periodate oxidation to obtain a highly reactive polysaccharide towards amines. Given the results of the preliminary studies, it was chosen to prepare a 30% oxidised pullulan. The Cathepsin K sensitive spacer Gly-Gly-Pro-Nle was then synthesised by solid phase peptide synthesis (SPPS) using the Fmoc strategy. Pactitaxel was coupled to the enzyme sensitive spacer and a self-immolative spacer via a six step synthesis to form a prodrug. Consecutively, the bone targeting agent alendronate was PEGylated via an activated carboxylic acid with N-hydroxysuccinimide. Finally, both “prodrugs” were successively anchored to the polysaccharide backbone through Schiff base formation and reductive amination. Once the polymer-drug conjugate, named Pull-PTX-ALN, was fully synthesised, physico-chemical characteristics of the colloid were investigated. All synthesised conjugates were characterised in terms of PTX and ALN contents, purity and stability under physiological conditions. These conjugates showed release of the anti-neoplastic drug only in presence of Cathepsin K at pH 5.5, confirming that, the type of bond chosen allows for the drug release under precise physiological conditions, in the bone metastases environment only. The polymer-drug conjugate bearing PTX and ALN also presented a high affinity for hydroxyapatite in vitro, proving the potential of alendronate as targeting agent. Cytotoxic activity was similar to free drug or in combination with alendronate in 4T1 cells (murine mammary adenocarcinoma cell line), MDA-MB-231 BM (human mammary adenocarcinoma from Bone Metastases cell line) and SAOS-2 (osteosarcoma cell line). Anti-angiogenic properties of alendronate in combination with paclitaxel were also assessed, as well as polymer conjugates challenging the materials with HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells). PTX and ALN together in their free form or conjugated onto Pullulan backbone presented a similar inhibition of proliferation and migration of HUVEC. Additionally, a reduction of capillary-like tube formation, by approximately 40-50%, was observed after 8hour incubation with the primary cell line.

RIASSUNTO Nell'ultima fase della malattia, i pazienti che hanno il cancro al seno spesso sviluppano metastasi ossee, una delle principali cause di morte legata al cancro tra le donne nel mondo. Il trattamento comune attualmente utilizzato clinicamente include l'agente anti-neoplastico paclitaxel (PTX) e il bisfosfonato alendronato (ALN). Il paclitaxel è un farmaco anti-neoplastico a quale l’effetto citotossico è attribuito principalmente alla sua capacità di impedire la depolimerizzazione dei microtubuli. La stabilizzazione dei microtubuli mitotici interrompe le funzioni che, in sequenza, blocca la divisione cellulare. Il paclitaxel è approvato per il trattamento del cancro dell'ovaio, della mammella, e del cancro ai polmoni in fase avanzata. Tuttavia, il farmaco anti-tumoure è altamente idrofobico e, di conseguenza, è scarsamente solubile in acqua. Inoltre, la formulazione di paclitaxel attualmente utilizzata in ambito clinico, nota come Taxolo, contiene il farmaco anti-neoplastico disciolto in una miscela di Cremophor EL ed etanolo per aumentarne la solubilità. Tuttavia, la somministrazione di Cremophor EL causa grave dose-limitante tossicità, come ipersensibilità e neuropatia. Infine, l'agente chemioterapeutico soffre di scarsa selettività verso i tumouri, e risulta in danneggiare le cellule normale e sane. Come risultato, molti sforzi sono stati compiuti per lo sviluppo di nuova formulazione di paclitaxel mediante polimerici biocompatibili e biodegradabili. Inoltre, metastasi ossee sono fonte di notevole preoccupazione per i pazienti con carcinoma della mammella in fase avanzata. I pazienti possono affrontare sfide supplementari al cancro come il declino della loro salute del squelette, e contribuisce a una manifesta diminuzione della qualità di vita e sopravvivenza. Alcuni bisfosfonati sono stati valutati in pazienti con metastasi ossee da tumoure primario della mammella, e più particolarmente l'alendronato, al fine di ridurre riassorbimento osseo e progressione del tumore. Il presente progetto mira allo sviluppo di un nuovo nano-sistema di veiculazione di farmaco al sito target, ed il rilascio controllato di farmaco anti-tumoure. Il modello sviluppato è un coniugato polimero-farmaco dove il farmaco anti-tumoure Paclitaxel - utilizzato per trattare il cancro della mammella - e l'alendronato, sono collegati ad un supporto polimerico naturale, il Pullulano, attraverso un distanziatore. Il coniugato polimero-farmaco, progettato per il rilascio controllato in particolare condizione fisiologiche, utilizza due meccanismi principali per il rilascio, compreso un idrolisi enzimatica e un idrolisi non-enzimatica. La scelta del distanziatore tra il polimero e il farmaco è stato fatta in modo che il rilascio del farmaco si verifica solo una volta che il sistema raggiunge le metastasi ossee, rilascio utilizzando una idrolisi enzimatica prima. Quando i coniugati polimero-farmaco sono elaborati per tumoure, il legame tra il farmaco e il polimero deve essere necessariamente stabile in condizioni fisiologiche fino a quando raggiunge il bersaglio tumourale. Il veicolo colloidale è stato progettato per migliorare la biofarmaceutica e le proprietà terapeutiche del farmaco anti-tumoure paclitaxel, aumentando la solubilità in acqua e l'individuazione del tumoure stesso. Il bisfosfonato alendronato è stato scelto come agente di mira a conferire una elevata affinità del coniugato verso la struttura di apatite di metastasi ossee, sfruttando la forte proprietà di grande affinità per l'osso dei bisfosfonati, insieme con il micro-ambiente di metastasi ossee, al fine di garantire un rilascio selettivo e l'accumulo dei farmaci anti-tumouri nel punto di azione desiderato; le metastasi ossee. Primo, gli studi preliminari sono state eseguiti studiando l'influenza del tempo di ossidazione del Pullulano sulla sua architettura (peso molecolare e polydispersivity). Il Pullulano è stato modificato per ossidazione con periodato in vista di ottenere un polisaccaride altamente reattivo verso le ammine. Dagli risultati di studi preliminari, si è scelto di preparare un Pullulano ossidato a 30%. Il distanziatore GlyGlyProNle sensibile alla Catepsina K è stato poi sintetizzato mediante il metodo sintesi di peptidi in fase solida (SPPS) usando la strategia Fmoc. Pactitaxel è stato accoppiato con il distanziatore sensibile all'enzima, ed con un distanziatore auto-immolative tramite una sintesi in sei passi, per formare un profarmaco. Consecutivamente, il targeting delle ossa è stato eseguito con l’alendronato, PEGilato tramite un acido carbossilico attivato con N-idrossisuccinimide. Infine, i due "profarmaci" sono stati successivamente ancorati al backbone del polisaccaride via formazione di base di Schiff e amminazione riduttiva. Una volta che il coniugato polimero-farmaco, chiamato Pull-PTX-ALN, è stato completamente sintetizzato, caratteristiche chimico-fisiche del colloide sono state investigate. Tutti gli coniugati sintetizzati sono stati caratterizzati in termine di contenuto in PTX e ALN, purezza e stabilità in condizioni fisiologiche. Questi coniugati hanno mostrato il rilascio del farmaco anti-neoplastici solo in presenza di catepsina K a pH 5,5 , confermando che il tipo di legame scelto consente il rilascio del farmaco sotto precise condizioni fisiologiche, solo nel ambiente delle metastasi ossee. Il coniugato polimero-farmaco, veiculando PTX e ALN, anche presenta un'alta affinità per l’idrossiapatite in vitro, dimostrando il potenziale del alendronato come agente di mira. L’attività citotossica era simile al farmaco libero o in combinazione con alendronato in linea cellululare 4T1 (linea cellulare adenocarcinoma mammario in murine), MDA-MB-231 BM (linea cellulare del adenocarcinoma mammario umano da metastasi ossee) e SAOS-2 (linea cellulare di osteosarcoma). Le proprietà anti-angiogeniche dell'alendronato in combinazione con paclitaxel sono state valutate con HUVEC (cellule umane endoteliali di vena ombelicale), anche per i coniugati polimero-farmaco. Il PTX e ALN insieme, nella loro forma libera, e coniugati al Pullulano, hanno presentato un'inibizione notevole della proliferazione e della migrazione delle cellule HUVEC. Inoltre, una riduzione della formazione di tubi capillari di circa 40-50 %, è stata osservata dopo 8 ore di incubazione con la linea cellulare.