The neuro-cardiac junction: the hotline for bidirectional dialogue between neurons and cardiomyocytes

Rationale: The heart is mainly innervated by the sympathetic nervous system that is involved in the fight or flight response. Sympathetic neurons (SNs), whose cell bodies are placed in the stellate and superior cervical ganglia, mediate the main physiological mechanism increasing the frequency and force of cardiac contraction through release of norepinephrine. Recently, we have reported that SNs regulate heart trophism through stimulation of β2 adrenergic receptors and repression of muscle specific ubiquitin ligases (i.e. Murf1 and Atrogin1) but not much is known about the effects of SNs on sarcomeres. Nerve growth factor (NGF) released by the myocardium controls cardiac innervation by SNs after binding to its receptor (TrkA) and is required for neuronal survival. Thus, bidirectional coupling between SGNs and the heart takes place: the heart needs to be coupled to the SNs to receive norepinephrine stimulation for an efficient increase in heart contraction, and conversely, SNs are coupled to the heart for neurotrophic stimulation that is required for neuronal viability. However, whether a cell-cell interaction occurs in the SN-heart coupling is not known. An interaction between the muscle and the neuron that has been well described both in terms of function and structure, is the neuro-muscular junction (NMJ), characterized by membrane thickenings, acetylcholinergic receptor clustering, reduced intermembrane space (70-50 nm) and neurotrophin release by the postsynaptic myocyte (e.g. NT3, NT4). Considering the interaction between the SNs and the heart (neuro-cardiac junction, NCJ), this study aims i) to evaluate the effects of anterograde SN stimulation on sarcomeric structures, ii) to determine whether specific cellular structures are present at the SN/Cardiomyocyte (CM) contact site, iiI) to investigate the role of SGN/CM contact in NGF-mediated signaling. Results: To analyze changes in sarcomere structure, cultured CMs were treated with adrenergic stimuli (clenbuterol, phenylephrine and norepinephrine) or nutrient/serum deprived by HBSS incubation. Since starvation and sympathetic denervation share common targets (e.g. ubiquitin ligases), we can make a parallelism between the two pro-atrophic stimuli for alterations in the sarcomeres. Incubation with adrenergic agonists did not cause significant changes, whereas starvation caused a 41.86% decrease in sarcomere area, suggesting that sarcomere degradation is faster than its synthesis. This result was confirmed by experiments of in live imaging performed on CMs transfected with a construct encoding for the z-line localized RFP-zasp. To understand whether all sarcomeric proteins share the same fate during HBSS treatment, immunofluorescence (IF) and western blot (WB) analyses were performed on different proteins localized in the sarcomeres. While α actinin and cardiac tropoinin (cTn) I showed delocalization and degradation, no significant changes were measured for cTnT upon HBSS treatment, suggesting that sarcomeric proteins are degraded in different ways. To understand which protein degradation system is involved in sarcomere disassembly, we considered the autophagy-lysosome and ubiquitin proteasome systems (UPS). WB and IF analyses supported the activation of both systems in cells treated with HBSS. In live imaging of CMs co-transfected with constructs encoding for RFP-zasp and EGFP-LC3 showed LC3 enrichment near sarcomeres in nutrient/serum deprived cells, suggesting that autophagy may be involved in sarcomere degradation. Moreover, IF staining showed ubiquitin marked sites near the M-line of sarcomeres in cells incubated with HBSS, suggesting that ubiquitin ligases may be involved in sarcomere disassembly. Since Murf1 is a muscle specific ubiquitin ligase, localized in the M-line of sarcomeres and upregulated upon nutrient/serum deprivation, we evaluated its role. Its overexpression caused a 88.57% decrease in the sarcomere area, when compared to controls, whereas its silencing in starved CMs did not prevent sarcomere degradation (446.19 ±35.65 vs 144.91 ±26.25 μm2 of sarcomeric area in controls and silenced CMs respectively). These results were confirmed by in live imaging on RFP-zasp transfected CMs, and suggest that UPS and in particular Murf1 are involved in HBSS induced sarcomeric disassembly and that Murf1-mediated degradation is not the only process. Considering the analysis of the neuro-cardiac interaction, IF staining on rat heart cryosections showed dense innervation of the heart by sympathetic neurons that mainly interact with CMs when compared to other cardiac cell types that are well represented in the heart (e.g. cardiac fibroblasts, CFs). Electron microscopy on mouse heart slices and rat SN/CM co-cultures showed a close association between SNs and CMs (intermembrane distance around 70 nm), neurotransmitter vesicle accumulation and increased membrane protein density. These data support that a direct interaction between the sympathetic neurons and the CMs exists. To analyze such interaction, SN/CM co-cultures were developed by isolating sympathetic ganglia neurons (SGN) from the superior cervical ganglia and CMs from the hearts of neonatal rats. Both cell types were characterized using IF staining for dopamine β-hydroxylase, a maker for noradrenergic neurons, and for α actinin, a sarcomeric protein. Moreover, IF staining showed an enrichment of cell-to-cell adhesion molecules including β-catenin and cadherin at the contact sites between processes and CMs. Such enrichment developed after 2 weeks of co-culture, suggesting that SGN/CM co-cultures are subjected to time dependent maturation. In spotted co-cultures allowing to identify processes on wither CMs or non CM cardiac cells (mainly fibroblasts), a higher area occupied by processes was measured on CMs when compared to the other cardiac cells after NGF withdrawal (67.11 ±12.36% vs 3.79 ±1.12% of area occupied by processes respectively), supporting the preferential interaction of SGNs with CMs. This idea is further supported by the observation that SGNs develop larger contact sites on CMs than in other cardiac cells (82.88 ±1.3% decrease in contact area on non CM cardiac cells when compared to CMs). Taken together, all these data suggest that SGNs establish a direct and stable interaction with CMs and not other cardiac cells. Since the myocardium is known to produce NGF that is required for SN viability, the functional role of the NCJ was assessed considering NGF signaling. This neurotrophin is synthesized by CMs, as detected by the western blot analysis. Transfection of CMs with siRNA against NGF caused a 72.91% decrease of the neurotrophin expression, reducing neuronal density in SGN/CM co-cultures (65.72 ±9.33% decrease in mean neuronal density when compared to the scramble siRNA). This effect was abolished by the addition of NGF in the culture medium and supports that SGNs are dependent on CM derived NGF. NGF binding to its receptor enables TrkA activation, endocytosis and retrograde transport to the neuronal soma. TrkA retrograde movements were assessed by monitoring transport velocity, using imaging in transiently TrkA-DsRed2 transfected SGNs. The speed of retrograde TrkA-DsRed2 movements depended on the presence of NGF (0.32 ±0.06 vs 0.19 ±0.03μm/s in presence or absence of NGF). In co-cultures, retrograde movements were higher and faster in processes contacting CMs than those contacting other cardiac cells (0.24 ±0.05 vs 0.11 ±0.02μm/s respectively), supporting the idea that TrkA is activated on CMs and not on the other cardiac cells and that SGN survival requires CM derived NGF. Since SGNs interact with CMs and depend on CM released NGF, we tested the hypothesis that the NCJ is necessary for neuronal survival. IF on mouse heart slices showed TrkA enrichment at SGN/CM contact site, suggesting that NGF signaling may be involved in the NCJ. Moreover, CM-conditioned medium did not prevent neuronal death (58.21 ±10.42% decrease in mean neuronal density when compared to SGN/CM co-cultures), suggesting that NGF in the medium is not sufficient for neuronal survival. Consistently, we measured NGF concentration in CM-conditioned medium and it was a 1000-fold lower than the minimal dose required for neuronal survival (0.13 ±0.08pM). To evaluate whether a single cell-to-single cell NGF signaling occurs between SGNs and CMs, co-cultures were co-transfected with siRNA against NGF and a plasmid encoding for the GFP that allows the identification of NGF silenced CMs. Sympathetic processes on NGF-silenced CMs showed a 19.56 ±4.01% decrease in the neuro-cardiac contact area when compared to those on untransfected CMs of the same co-culture, supporting that direct cell-cell NGF mediated signaling is present. Moreover, co-cultures were transfected with a construct encoding NGF in order to detect NGF accumulation in processes using the IF. Only processes in contact with transfected CM contained NGF puncta, while those in contact with untransfected cells of the same co-culture did not contain NGF (43.43 ±10.77 vs 4.17 ± 4.1% of processes on transfected or un-transfected CMs). Taken together, these data suggest that the establishment of a neuro-cardiac interaction is necessary to allow NGF signaling. In the end of this work, we interfered with NGF signaling using different strategies. First, we used an anti-NGF antibody to sequester NGF. Second, since from TEM analysis we detected sites of cell-to-cell distance of 10nm, we used the smaller TrkA antagonist c(92-96). Third, we used k252a that has a size comparable to that of c(92-96) and that is membrane permeable. Whereas every approach worked on SGNs alone leading to a significant reduction in neuronal density, only k252a was able to reduce neuronal density in co-cultures (73.24 ±4.18% decrease in mean neuronal density when compared to the control), suggesting that the NCJ is an isolated microenvironment protected from diffusion. Since k252a led to neuronal loss in co-cultures, we used this inhibitor to estimate NGF concentration at the contact site, incubating SGNs alone with k252a and NGF at increasing concentrations. The estimated concentration was 1.4 ±0.03nM, 3.5 times higher than the minimal dose required for neuronal survival, supporting that the NCJ is characterized by high NGF concentration. Conclusions: Taken together, our results suggest that sympathetic neurons establish a direct interaction with CMs and that they are dependent on CM derived NGF. Morever, NGF-dependent pro-survival signal to the SGN needs this direct interaction that facilitates NGF activation of TrkA thanks to the development of an isolated microdomain characterized by a high NGF concentration and TrkA enrichment. Finally, sarcomere dismantlement during atrophic remodeling involves the activation of protein degradation systems and in particular of the ubiquitin ligase Murf1, whose regulation by SNs may affect sarcomere structure

Introduzione: il cuore è innervato principalmente dal sistema nervoso simpatico coinvolto nella risposta ‘lotta o fuga’. I neuroni simpatici (NS) sono collocati nei gangli stellato e cervicale superiore e mediano il principale meccanismo fisiologico per aumentare la frequenza e la forza di contrazione cardiaca attraverso il rilascio di noradrenalina. Recentemente abbiamo riportato che i NS regolano il trofismo cardiaco attraverso la stimolazione dei recettori β2 adrenergici e la repressione delle ubiquitina ligasi muscolo specifiche (ovvero MuRF1 e Atrogin1), ma non si conoscono gli effetti dei NS sui sarcomeri. Il fattore di crescita neuronale (NGF) è rilasciato dal miocardio e controlla l’innervazione cardiaca da parte dei NS dopo il legame al suo recettore (TrkA) ed è necessario per la sopravvivenza neuronale. Di conseguenza l'accoppiamento tra neuroni simpatici e il cuore riguarda una comunicazione bidirezionale: il cuore ha bisogno di essere accoppiato ai NS per ricevere lo stimolo noradrenergico per un aumento efficiente della contrazione del cuore, e, viceversa, i NS sono accoppiati al cuore per ricevere lo stimolo neurotrofico che è necessario per la sopravvivenza dei neuroni. Tuttavia, non si conosce se è presente un’interazione cellula-cellula nell’accoppiamento tra cuore e neuroni. La giunzione neuromuscolare (GNM) costituisce un’interazione tra il muscolo e il neurone, ben descritta sia in termini di funzione che di struttura. E’ caratterizzata da ispessimenti della membrana, accumulo dei recettori acetilcolinergici, ridotto spazio intermembrana (70-50 nm) e rilascio di neurotrofine da parte dei miociti (ad esempio NT3, NT4). Considerando l'interazione tra i NS ed il cuore (giunzione neuro cardiaca, GNC), questo studio ha lo scopo di i) valutare gli effetti della stimolazione anterograda dei NS sulle strutture sarcomeriche, ii) determinare se strutture cellulari specifiche sono presenti a livello del sito di contatto tra NS e cardiomiocita, iii) studiare il ruolo del contatto tra cardiomiociti e neuroni nella segnalazione mediata da NGF. Risultati: Per analizzare i cambiamenti nella struttura del sarcomero, colture di cardiomiociti sono state trattate con stimoli adrenergici (clenbuterolo , fenilefrina e norepinefrina) oppure con HBSS. Poiché la rimozione di nutrienti e la denervazione simpatica agiscono su meccanismi comuni, possiamo fare un parallelismo tra i due stimoli proatrofici sull’alterazione nei sarcomeri. L’incubazione con agonisti adrenergici non ha causato cambiamenti significativi, mentre l’HBSS ha provocato una diminuzione del 41.86% dell’area sarcomerica, suggerendo che la degradazione dei sarcomeri è più veloce rispetto alla loro sintesi. Questo risultato è stato confermato da esperimenti di imaging in tempo reale su CM trasfettati con un costrutto codificante per la RFP-zasp, proteina localizzata nella linea z. Per capire se le proteine sarcomeriche condividono lo stesso destino durante il trattamento con HBSS, sono state effettuate analisi di immunofluorescenza (IF) e western blot (WB). Mentre α actinina e troponina cardiaca (cTn) I hanno mostrato delocalizzazione e degradazione, non sono stati misurati cambiamenti significativi per cTnT in seguito al trattamento con HBSS, suggerendo che le proteine sarcomeriche sono degradate in modi diversi. Per capire quale meccanismo di degradazione delle proteine è coinvolto nello smantellamento dei sarcomeri, abbiamo considerato il sistema autofagico-lisosomale e ubiquitina-proteasoma. Analisi di WB e IF hanno mostrato l'attivazione di entrambi i sistemi in cellule trattate con HBSS. In esperimenti di imaging in tempo reale su cardiomiociti co-trasfettati con costrutti codificanti per RFP-zasp e EGFP-LC3 è stato osservato l’arricchimento di LC3 vicino ai sarcomeri in seguito a deprivazione di nutrienti e siero, suggerendo che l’autofagia potrebbe essere coinvolta nella degradazione dei sarcomeri. Inoltre analisi di IF hanno mostrato una marcatura per l’ubiquitina in corrispondenza della linea M dei sarcomeri in cellule incubate con HBSS, suggerendo che le ubiquitina ligasi potrebbero essere coinvolte nello smantellamento dei sarcomeri. Poiché MuRF1 è un’ubiquitina ligasi muscolo specifica localizzata nella linea M dei sarcomeri e sovraespressa in condizioni di digiuno, abbiamo valutato il suo ruolo nella degradazione delle proteine sarcomeriche. La sua sovraespressione ha provocato un calo dell’area sarcomerica dell’88.57% rispetto ai controlli, mentre il suo silenziamento in cardiomiociti incubati con HBSS non ha impedito la degradazione dei sarcomeri (446.19 ±35.65 vs 144.91 ±26.25μm2 di area sarcomerica nei controlli e nei cardiomiociti silenziati e incubati con HBSS rispettivamente). Questi risultati sono stati confermati da esperimenti di imaging in tempo reale su cardiomiociti trasfettati con RFP-zasp, e suggeriscono che il sistema ubiquitina-proteasoma ed in particolare Murf1 siano coinvolti nella degradazione dei sarcomeri, anche se quello mediato da Murf1 non è l’unico meccanismo. Considerando l'analisi dell’interazione neuro-cardiaca, le analisi di IF su criosezioni di cuore di ratto hanno mostrato densa innervazione del cuore da parte dei neuroni simpatici che sembrano interagire soprattutto con cardiomiociti rispetto ad altri tipi cellulari che sono ben rappresentati nel cuore (ad esempio fibroblasti cardiaci, FC). L’analisi di microscopia elettronica su criosezioni cardiache di topo e ratto e co-culture di NS e cardiomiociti ha mostrato una stretta associazione tra NS e cardiomiociti (con una distanza intermembrana di circa 70nm), accumulo di vescicole di neurotrasmettitore e l'aumento della densità delle proteine di membrana. Questi dati supportano l’esistenza dell'interazione diretta tra i neuroni simpatici e i cardiomiociti. Per analizzare tale interazione, sono state sviluppate co-culture di NS e cardiomiociti, isolando i neuroni simpatici gangliari (NSG) dai gangli cervicali superiori e i cardiomiociti dal cuore dei ratti neonati. Entrambi i tipi cellulari sono stati caratterizzati analizzando in IF la dopamina β-idrossilasi, un marcatore per i neuroni noradrenergici, e l’α actinina, una proteina sarcomerica. Inoltre l’arricchimento di molecole di adesione cellula-cellula, tra cui β catenina e caderina, è stato osservato nei siti di contatto tra processi simpatici e cardiomiociti. Tale arricchimento è stato misurato dopo 2 settimane di co-coltura, suggerendo che co-culture di neuroni e cardiomiociti sono sottoposte a maturazione in funzione del tempo. In co-colture a spot, che consentono di identificare processi in contatto con cardiomiociti o altre cellule cardiache (principalmente fibroblasti), una superficie superiore era occupata dai processi simpatici su cardiomiociti rispetto alle altre cellule cardiache dopo la rimozioni dell’NGF (67.11 ±12.36% vs 3.79 ±1.12% della superficie occupata da processi rispettivamente), sostenendo la presenza di un’interazione preferenziale tra neuroni e cardiomiociti. Questo concetto è ulteriormente supportato dall'osservazione che i neuroni simpatici sviluppano contatti più grandi sui cardiomiociti che su altre cellule cardiache (82.88 ±1.3% di diminuzione della superficie di contatto su altre cellule cardiache rispetto ai cardiomiociti). Nell’insieme, questi dati suggeriscono che i NS stabiliscono un’interazione diretta e stabile con i cardiomiociti e non altre cellule cardiache. Poiché si conosce che il miocardio produce NGF che è necessario per la vitalità dei NS, il ruolo funzionale della GNC è stato valutato considerando il signaling mediato dall’NGF. Questa neurotrofina è sintetizzata dai cardiomiociti, come rilevato dalle analisi di western blot. La trasfezione di siRNA contro l’NGF nei cardiomiociti ha causato una diminuzione del 72.91% nell'espressione della neurotrofina e ridotto la densità neuronale in co-culture di neuroni e cardiomiociti (65.72 ±9.33% di diminuzione della densità neuronale rispetto alla trasfezione con il siRNA di controllo). Questo effetto è stato abolito dall'aggiunta di NGF nel mezzo di coltura e supporta che i neuroni dipendono dall’NGF prodotto dai cardiomiociti. Il legame dell’NGF al suo recettore TrkA consente la sua attivazione, endocitosi e trasporto retrogrado al soma neuronale. Sono stati valutati i movimenti retrogradi del TrkA, monitorando la velocità di trasporto utilizzando tecniche di imaging in tempo reale in co-culture con NS trasfettati con il costrutto TrkA-DsRed2. La velocità dei movimenti retrogradi del TrkA-DsRed2 nei neuroni dipende dalla presenza di NGF (0.32 ±0.06 vs 0.19 ± 0.03μm/s in presenza o assenza di NGF). In co-culture, i movimenti retrogradi erano più alti e più veloce nei processi in contatto con cardiomiociti rispetto ad altre cellule cardiache (0.24 ±0.05 vs 0.11 ±0.02μm/s rispettivamente), sostenendo l'idea che il TrkA è attivato sui cardiomiociti e non sulle altre cellule cardiache e che i neuroni dipendono da NGF derivato da cardiomiociti. Poiché i NS interagiscono con i cardiomiociti e sono dipendenti dall’NGF che questi rilasciano, abbiamo testato l'ipotesi secondo cui la GNC sia necessaria per la sopravvivenza neuronale. Analisi di IF su criosezioni di cuore murino hanno mostrato accumulo di TrkA nel sito di contatto tra il cardiomiocita e il NS, suggerendo che il signaling mediato dall’NGF potrebbe essere coinvolto nella GNC. Inoltre, terreno condizionato da cardiomiociti non ha impedito la morte neuronale (58.21 ±10.42% di diminuzione della densità neuronale rispetto alla co-cultura), suggerendo che l’NGF nel mezzo non sia sufficiente per la sopravvivenza neuronale. Coerentemente abbiamo misurato la concentrazione di NGF nel terreno condizionato da cardiomiociti ed è risultata 1000 volte inferiore rispetto alla dose minima necessaria per la sopravvivenza neuronale (0.13 ±0.08pM). Per valutare se il signaling mediato dall’NGF avviene da una singola cellula all’altra, co-culture sono state co-trasfettate con siRNA contro l’NGF e un plasmide codificante per la GFP che permette l'identificazione dei cardiomiociti silenziati per la neurotrofina. I processi simpatici su cardiomiociti silenziati hanno mostrato una riduzione del 19.56 ±4,01% della zona di contatto neuro-cardiaca rispetto ai cardiomiociti non trasfettati della stessa co-coltura, a sostegno del fatto che il singaling dell’NGF sia localizzato nel sito di contatto tra una cellula e l’altra. Inoltre, le co-colture sono state trasfettate con un costrutto codificante per l’NGF per rilevare l’accumulo della neurotrofina nei processi utilizzando tecniche di IF. Solo i processi in contatto con i cardiomiociti trasfettati contenevano accumuli di NGF, mentre quelli a contatto con cardiomiociti non trasfettati non possedevano NGF (43.43 ±4.17 vs 10.77 ±4.1% dei processi in contatto con cardiomiociti trasfettati e non rispettivamente). Nel loro insieme, questi dati suggeriscono che la presenza dell’interazione neuro-cardiaca sia necessaria per consentire la segnalazione dell’ NGF. Alla fine di questo lavoro abbiamo interferito con il signaling dell’NGF utilizzando diverse strategie. In primo luogo abbiamo utilizzato un anticorpo anti-NGF per sequestrare la neurotrofina dal terreno. In secondo luogo, poiché nelle analisi di microscopia elettronica abbiamo rilevato siti di distanza cellula-cellula di 10nm, abbiamo usato un antagonista del TrkA più piccolo dell’anticorpo, il c(92-96). In terzo luogo abbiamo utilizzato il k252a che ha una dimensione paragonabile a quella del c(92-96) e che è permeabile alle membrane. Considerando che ogni approccio ha funzionato sui NS, causando una significativa riduzione della densità neuronale, solo il k252a è stato in grado di ridurre la densità neuronale in co-colture (73.24 ±4.18% di diminuzione della densità neuronale media rispetto al controllo), suggerendo che la GNC è un microambiente isolato protetto dalla diffusione. Poiché il k252a ha causato la riduzione neuronale in co-colture, abbiamo usato questo inibitore per stimare la concentrazione di NGF nel sito di contatto, incubando i neuroni da soli con k252a e NGF in concentrazioni crescenti. La concentrazione stimata è stata di 1.4 ±0.03nM, 3.5 volte superiore alla dose minima necessaria per la sopravvivenza neuronale, supportando che la GNC è caratterizzata da un'alta concentrazione di NGF. Conclusioni: Nell’insieme, i nostri risultati suggeriscono che i neuroni simpatici stabiliscono un’interazione diretta con i cardiomiociti e che dipendono dall’NGF derivato dai cardiomiociti. Inoltre, il signaling mediato dall’NGF necessita di questa interazione diretta che facilita l’attivazione del TrkA grazie allo sviluppo di un microdominio isolato e caratterizzato da una elevata concentrazione di NGF e dall’arricchimento del TrkA. Infine, lo smantellamento dei sarcomeri comporta l'attivazione dei sistemi di degradazione delle proteine e, in particolare, dell’ubiquitina ligasi MuRF1, la cui modulazione da parte dei NS può modificare la struttura del sarcomero