Derivazione e caratterizzazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) per la produzione di megacariociti

Introduction: Thrombocytopenia consists in a lack of blood platelets. Hereditary forms have limited therapeutic possibilities, such as platelets transfusions that only temporarily restore the defect and can lead to the formation of anti-platelet antibodies, reducing thus the effectiveness of subsequent infusions. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) hold the great potential to be differentiated into the cells of all the three germ layers, being moreover patient-specific and representing a great tool for the production of autologous platelets. Aim: aim of this study was to reprogram human somatic cells to iPSCs, for the treatment of platelet’s disorders. For this purpose iPSCs were derived from fibroblasts by both integrating and non-integrating methods and were differentiated along the hematopoietic lineage to give rise to platelets producing megakaryocytes. Materials and Methods: iPS cells were derived by three different reprogramming protocols including retroviral vectors (RV), Sendai virus vectors (SeV) and episomal vectors (EpV), all expressing the four transcription factors, OCT4, SOX2, KLF4, c-Myc. iPSC clones were then fully characterized and differentiated into megakaryocytes by direct differentiation. Results: In this study more than thirty iPSCs clones were derived by RV and SeV transduction and EpV transfection. Six iPSCs clones were fully characterized. The reprogramming protocol based on adenoviral vectors (AdV) resulted inefficient. iPSCs-derived megakaryocytes appeared as multinucleated cells, with protrusions on the surface similar to the pro-platelets and able to release anucleate cells. Conclusions: iPS clones were successfully derived by integrating and non-integrating viral vectors, and non-integrating vectors. All characterized clones expressed all the markers of pluripotency as well as the markers of the three germ layers upon embryoid bodies (EBs) formation. A new protocol for direct differentiation of iPSCs into megakaryocytes was developed, holding a great potential for patient-specific treatment by a tailored-therapy for platelet disorders

Introduzione: Il termine trombocitopenia, o piastrinopenia, indica la carenza di piastrine nel sangue. Le possibilità terapeutiche per le forme ereditarie sono molto limitate in particolare sono disponibili trasfusioni di piastrine che correggono il difetto solo per pochi giorni e possono indurre la formazione di anticorpi che riducono l’efficacia delle infusioni successive. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) sono in grado di produrre cellule appartenenti a tutti e tre i foglietti germinativi e possono rappresentare un sistema efficiente per produrre piastrine autologhe paziente-specifiche. Scopo dello studio: L’obiettivo di questo studio è stato la riprogrammazione di cellule somatiche umane a cellule staminali pluripotenti indotte (iPSc), per il trattamentodi patologie piastriniche. A questo scopo le iPSCs sono state riprogrammate avvalendosi sia di protocolli integranti che non-integranti e differenziate lungo in lineage ematopoietico allo scopo di ottenere megacariociti in grado di produrre piastrine. Materiali e metodi: Le cellule iPS sono state derivate mediante tre differenti metodi di riprogrammazione tra cui i vettori retrovirali (RV), derivati dal virus del Sendai (SeV) ed episomali (EpV). Tutti i vettori esprimevano i quattro fattori di trascrizione Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Successivamente i cloni iPSCs sono stati completamente caratterizzati e differenziati in megacariociti mediante differenziamento diretto. Risultati: In questo studio sono stati derivati più di 30 cloni IPSCs mediante trasduzione di vettori RV e SeV e trasfezione con vettori EpV. Il protocollo di riprogrammazione basato sui vettori adenovirali (AdV) si è rivelato inefficiente. I megacariociti derivati dalle cellule iPS risultavano polinucleati, con estroflessioni sulla superficie simili alle pro-piastrine e in grado di rilasciare cellule anucleate. Conclusioni: In conclusione sono stati derivati con successo cloni di iPSC con vettori virali integranti retrovirali, con vettori virali non integranti derivati dal virus del Sendai e con vettori non virali, non integranti, quali i vettori episomali. Tutti i cloni ottenuti esprimevano tutti i marcatori di pluripotenza e una volta formati i corpi embrioni (EBs), tutti esprimevano anche i marcatori dei tre i foglietti germinativi. Inoltre è stato sviluppato un nuovo protocollo di differenziamento diretto da iPSCs a megacariociti in grado di creare una terapia su misura per pazienti con disordini piastrinici