The endoplasmic reticulum-mitochondria coupling: role of Presenilin-2

Alzheimer’s Disease (AD) is the most frequent form of dementia. A small percentage of cases is inherited (Familial AD, FAD) and is due to dominant mutations on three genes, coding for Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin-1 (PS1) and Presenilin-2 (PS2). Mutations in these proteins cause alterations in the cleavage of APP by a PS1- or PS2- containing enzyme, named У-secretase, thus leading to an increase in the ratio between Aß42 and Aß40, the two main peptides finally derived from APP maturation. This in turn would increase the deposition of the “Amyloid Plaques”, one of the main histopathological feature of AD. To date, the generation of Aß42 peptides, its oligomers and finally amyloid plaques is the core of the most widely accepted pathogenic hypothesis for AD, the “Amyloid Cascade Hypothesis”. PS1 and PS2 are ubiquitous “9 trans-membrane domains” homologous proteins localized mainly in the membranes of Endoplasmic Reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes and plasma membrane. Despite being the catalytic core of У-secretase, PSs display also some specialized, У-secretase independent activities. On this line, numerous studies reported a role for FAD-linked PS mutations in cellular calcium (Ca2+) alterations. Ca2+ is a key second messenger in living cells and it regulates a multitude of cell functions; thus, alterations in its signaling cascade can be detrimental for cell fate. Ca2+ mishandling has been proposed as a causative mechanism for different neurodegenerative diseases and in particular for AD. Although supported by several groups for many years, the Ca2+ hypothesis for AD pathogenesis has never been undisputedly accepted, since some data were clearly in contrast, especially those considering PS2 mutations. In our lab, it was previously shown that several FAD PS2 mutants, but not PS1, reduce ER and Golgi apparatus Ca2+ content, mainly by interfering with SERCA activity. Over the last decade, evidence has accumulated on the existence of continuous flux of information between the ER and mitochondria, two organelles whose privileged interplay modulate key aspects of cell pathophysiology, ranging from lipid metabolism and Ca2+ homeostasis to cell death. Several proteins have been suggested to be involved in keeping the ER and mitochondria at a given distance, allowing the correct organization, their mutual interactions and Ca2+ cross-talk. Among them, mitofusin 2 (Mfn2), which is located on both the outer mitochondrial membrane (OMM) and the ER surface, has been shown to take part in homotypic interactions that contribute to the tethering at the level of mitochondria-associated-membranes.(MAMs). Interestingly, also PS1 and PS2 are enriched in MAMs: we have recently demonstrated that PS2, but not PS1, is able to modulate ER-mitochondria tethering and their Ca2+ cross-talk, with PS2-FAD mutants more potent than their wt counterpart in this novel function. We here investigate the molecular mechanism by which PS2 favours ER-mt tethering, taking into consideration the possibility that PS2 effect depends on the presence of Mfn2. By crossed genetic complementation and ablation experiments, we found that, in order to modulate ER-mitochondria coupling, PS2 requires the expression of Mfn2 and viceversa. In contrast, their homologues PS1 and Mitofusin 1 (Mfn1) are completely dispensable for these functions. Functional and biochemical evidence indicates that PS2 (wt and FAD) needs to physically interact, via its big cytosolic loop, with Mfn2 at both sides of MAM domains, likely forming, or stabilizing, a triple complex made by itself, ER and mitochondrial Mfn2. Our results clearly suggest that PS2 and Mfn2 cooperate and need one each other to promote ER-mitochondria apposition. On the contrary, their homologues PS1 and Mfn1 are completely dispensable in this function. In order to explain the stronger effect of FAD-PS2 compared to wt, we performed protein subcellular fractionation from mouse brains, and we observed that in transgenic (tg) mice, carrying FAD-PS2-N141I mutation, PS2 is strongly enriched in MAMs, compared to controls. Moreover, in tg mice also Mfn2 levels are slightly increased in MAMs, thus possibly explaining the stronger tethering in presence of FAD mutations. We proposed a model in which, being FAD-PS2 more enriched in MAMs compared to wt, it could here recruit more Mfn2 (by physically interacting with it both in cis and in trans) and form more PS2-Mfn2 complexes critical for determining the apposition between the two organelles. Finally, the increase in ER-mitochondria coupling was observed not only in FAD-models over-expressing the mutated form of PS2, but also in human fibroblasts from patient carrying the PS2-N141I mutation, thus a condition in which the mutated protein exerts its function independently of any artefact due to its over-expression. Further investigations will be focused to highlight the mechanism that promotes accumulation into MAMs of FAD-PS2 and whether these stronger FAD-PS2-linked effects on ER-mitochondria coupling are involved in the pathogenesis of AD

La malattia di Alzheimer (AD) è la forma più frequente di demenza. Una piccola percentuale dei casi è ereditaria (Familial AD, FAD) ed è dovuta a mutazioni autosomiche dominanti in tre geni, che codificano per la Proteina Precursore dell’Amiloide (APP), per Presenilina-1 (PS1) e per Presenilina-2 (PS2). Le mutazioni in queste proteine causano alterazioni nella maturazione di APP da parte di un enzima (detto У-secretasi) che contiene alternativamente PS1 o PS2, portando così ad un aumento del rapporto tra Aß42 e Aß40, che sono i due principali peptidi prodotti in seguito al taglio di APP. Questo a sua volta induce un aumento della deposizione delle “placche amiloidi”, uno dei principali marcatori isto-patologici dell’AD. La generazione del peptide Aß42, dei suoi oligomeri e delle placche amiloidi costituisce il core dell’ipotesi patogenica ad oggi più accreditata per spiegare l’insorgenza della malattia di Alzheimer, ossia “l’ipotesi della cascata amiloide”. PS1 e PS2 sono proteine omologhe ubiquitarie con 9 domini trans-membrana, principalmente localizzate nelle membrane del reticolo endoplasmatico (ER), dell’apparato del Golgi, degli endosomi e in membrana plasmatica. Oltre a costituire il nucleo catalitico della У-secretasi, le preseniline possiedono anche delle attività specializzate У-secretasi indipendenti, talvolta non ridondanti tra le due proteine. Per esempio, molti studi hanno evidenziato un ruolo per alcune mutazioni nelle Preseniline associate a FAD nell’alterazione dell’omeostasi del calcio (Ca2+) intracellulare. Il Ca2+ è un secondo messaggero chiave per le cellule e regola numerose funzioni cellulari; pertanto, alterazioni nelle dinamiche di questo ione possono essere estremamente dannose per le cellule e sono state proposte essere alla base di diverse patologie neurodegenerative, tra cui in particolare l’AD. Sebbene sia stata ampiamente supportata da vari gruppi, l’ipotesi dell’alterazione dell’omeostasi del Ca2+ alla base dell’insorgenza dell’AD non è mai stata completamente accettata, dal momento che alcuni dati sono chiaramente discordanti, soprattutto per quanto riguarda alcune mutazioni in PS2. Nel nostro laboratorio, è stato in precedenza dimostrato che diverse mutazioni associate a FAD in PS2, ma non in PS1, riducono il contenuto di Ca2+ nell’ER e nell’apparato del Golgi, principalmente attraverso una inibizione della pompa SERCA. Negli ultimi anni, crescenti evidenze hanno dimostrato l’esistenza di un continuo flusso di informazioni tra l’ER e i mitocondri, due organelli la cui interrelazione modula aspetti chiave nella pato-fisiologia delle cellule, dal metabolismo lipidico alla regolazione dell’omeostasi del Ca2+, fino alla morte cellulare. Diverse proteine sono state coinvolte nel mantenimento di una appropriata distanza tra l’ER e i mitocondri, permettendo così una corretta organizzazione delle loro reciproche interazioni e dello scambio di Ca2+ tra di essi. Tra queste è stato proposto che Mitofusina-2 (Mfn2), localizzata sia sulla membrana mitocondriale esterna (OMM) che, in minore percentuale, sulla superficie dell’ER, moduli il tethering fisico tra i due organelli, attraverso delle interazioni di tipo omotipico a livello delle “membrane associate ai mitocondri” (MAM). Anche PS1 e PS2 sono arricchite a livello delle MAM: nel nostro laboratorio abbiamo recentemente dimostrato che PS2, ma non PS1, modula la vicinanza fisica tra l’ER e i mitocondri, influenzando così lo scambio di Ca2+ tra di essi. Nel lavoro presentato in questa tesi, abbiamo studiato attraverso quale meccanismo molecolare PS2 è in grado di influenzare il tethering, prendendo in considerazione la possibilità che l’effetto di PS2 dipenda in qualche modo dalla presenza di Mfn2. Attraverso esperimenti incrociati di ablazione e ricostituzione genetica, abbiamo dimostrato che per modulare l’accoppiamento tra i due organelli PS2 necessita dell’espressione di Mfn2, e viceversa. Al contrario, le loro proteine omologhe PS1 e Mitofusina-1 (Mfn1) non sembrano essere coinvolte in queste funzioni. Evidenze funzionali e biochimiche indicano che PS2 (wt e FAD) interagisce fisicamente attraverso il suo esteso dominio citosolico con Mfn2 presente in entrambi i lati delle MAM, probabilmente formando o stabilizzando un triplice complesso formato da PS2, da Mfn2 sull’ER e da Mfn2 sulla OMM. I risultati qui esposti suggeriscono che PS2 e Mfn2 cooperano e necessitano reciprocamente una dell’altra per mantenere il tethering tra ER e mitocondri, mentre invece PS1 e Mfn1 non sono necessarie. Per spiegare l’effetto potenziato sull’accoppiamento tra i due organelli delle forme mutate di PS2 associate a FAD, rispetto alla proteina wt, abbiamo effettuato dei sub-frazionamenti proteici a partire da cervelli di topi. Ciò che abbiamo osservato è che nei topi transgenici (tg), che portano la mutazione associata a FAD PS2-N141I, PS2 è fortemente arricchita a livello delle MAM, rispetto ai controlli. Inoltre, nei topi transgenici anche Mfn2 è leggermente arricchita nelle MAM, il che potrebbe forse spiegare l’effetto più forte sul tethering delle mutazioni FAD. Il modello che proponiamo è che, essendo la PS2 mutata più arricchita nelle MAM rispetto alla forma wt, recluti più Mfn2 (interagendo con essa sia in cis che in trans) e formi più complessi PS2-Mfn2, i quali sono fondamentali per determinare l’accoppiamento tra i due organelli. Infine, l’aumentato tethering tra ER e mitocondri è stato osservato anche in fibroblasti di un paziente FAD con la mutazione PS2-N141I, ossia una condizione in cui la proteina mutata esercita la sua funzione indipendentemente da qualsiasi possibile artefatto legato alla sua sovra-espressione. Ulteriori studi saranno necessari per capire quale meccanismo favorisce l’accumulo di PS2 mutata nelle MAM e se l’aumentata vicinanza tra ER e mitocondri, osservata in presenza delle mutazioni in PS2 associate a FAD, sia in qualche modo coinvolta nell’insorgenza o, quantomeno, nella progressione della malattia di Alzheimer