Characterization and expression analysis of ambra1a and ambra1b genes in zebrafish and study of their roles during early development

The study of autophagy is a new research field that has recently obtained great attention due to the involvement of autophagy in several developmental and pathophysiological processes. In the last years, zebrafish has become a powerful model organism to study the genes that play important roles during development, and thus, in this project, I used a reverse genetics approach and the zebrafish as a model organism to study the role and the functions of Ambra1, a key protein involved in the early steps of autophagosome formation. Ambra1-deficient mice are embryonic lethal, and show defects in the central nervous system, with hyperproliferation of the neuroepithelium, exencephaly and imperfect closure of the neural tube, thus suggesting that, in mouse, Ambra1 is crucial for the proper nervous system development. In the chapter I, it is described the identification and characterization of the two paralogous genes, ambra1a and ambra1b, which encode the two isoforms of this protein in zebrafish. Transcripts of both genes are present as maternal RNAs in the early stages of development, while afterwards they are mainly localized in the head, suggesting a potential role for these proteins in the development of the central nervous system also in zebrafish. The knockdown of both proteins is associated with severe developmental abnormalities, early embryonic lethality and deficiency of the autophagic process. Moreover, the results obtained suggest the possible acquisition of specific functions by the two paralogous genes that are both required during development and do not compensate each other following knockdown. In chapter II the possibility that, also in zebrafish, functional silencing of Ambra1 could lead to uncontrolled cell proliferation was confirmed by Phospho-Histone-H3 immunohistochemistry in both ambra1 zebrafish morphants. Moreover, the cell-autonomous capability of Ambra1-depleted cells to hyperproliferate was analysed by transplantation experiments that showed a higher proliferation rate in ambra1a and ambra1b chimeras with respect to controls. Chapter III describes involvement of Ambra1a and Ambra1b on zebrafish skeletal muscle development and compares the phenotype of zebrafish ambra1-depleted embryos with that of Ambra1gt/gt mouse embryos. Morphological analysis of morphant embryos reveals that the silencing of ambra1 impairs locomotor activity and muscle development. More severe phenotypes are obtained by knockdown of maternal transcripts, therefore, underlining the role of these proteins during development. Finally, Chapter IV reports the cloning and characterization of ambra1 in the tunicate Botryllus schlosseri, a model species of a colonial ascidian. This is the first characterization of ambra1 transcripts in a non-vertebrate organism. The deduced amino acid sequence is shorter then vertebrate Ambra1 proteins but still contains the WD40 domain as well as other amino acid residues that are important for polyubiquitination or caspase cleavage of the protein. However, the B. schlosseri protein lacks other important domain such as the DLC1-binding consensus motifs (TQT) that, in vertebrates, docks the protein at its specific cytoskeletal site. Expression of these genes was found in all the different stages of the life cycle analysed.

Lo studio dell’autofagia costituisce un campo di ricerca che ha recentemente ottenuto una notevole attenzione grazie al coinvolgimento che questo processo sembra avere sia durante lo sviluppo sia, nella vita adulta, in numerose condizioni fisiologiche e patologiche. In questo progetto di ricerca ho utilizzato lo zebrafish come organismo modello e applicato un approccio di genetica inversa per la caratterizzazione e lo studio delle funzioni di Ambra 1, una proteina chiave coinvolta nelle fasi iniziali di formazione della vescicola autofagosomica. Nel topo, il silenziamento di Ambra1 porta non solo ad una riduzione dell’attività autofagica ma anche a letalità embrionale e al mancato sviluppo del sistema nervoso centrale. Gli embrioni presentano iperproliferazione del neuroepitelio, esencefalia e chiusura imperfetta del tubo neurale, risultati che suggeriscono un ruolo cruciale di Ambra1 per un corretto sviluppo del sistema nervoso. La tesi è stata divisa in quattro capitoli il primo dei quali descrive l’identificazione e la caratterizzazione dei due geni paraloghi ambra1a e ambra1b, che codificano per le due isoforme di questa proteina presenti nello zebrafish. I trascritti di entrambi i geni sono presenti, nell’ovocita e durante le prime ore dello sviluppo, come mRNA materno mentre a stadi successivi i trascritti materni vengono degradati e sostituiti da quelli embrionali. Questi si localizzano prevalentemente a livello cefalico suggerendo un potenziale ruolo di queste proteine anche nello sviluppo del sistema nervoso centrale dello zebrafish. Gli embrioni ottenuti dopo silenziamento delle due proteine presentano letalità a stadi di sviluppo precoci, numerose alterazioni morfologiche e una significativa riduzione dell’attività autofagica. Inoltre, i risultati ottenuti suggeriscono la possibile acquisizione di funzioni specifiche da parte dei due geni paraloghi, geni che sono entrambi necessari per uno sviluppo corretto e che non si compensano uno con l’altro in seguito al silenziamento. Nel Capitolo II è stato confermato, mediante colorazione immunoistochimica per l’istone H3 fosforilato, che il silenziamento di entrambi i geni porta ad un aumento della proliferazione cellulare. Inoltre, è stato dimostrato, mediante esperimenti di trapianto cellulare, che cellule prive di Ambra1 sono in grado di iperproliferare in maniera cellulo-autonoma. E’ stata, infatti, osservata una maggiore proliferazione cellulare nelle chimere ambra1a e ambra1b rispetto ai controlli. Il Capitolo III descrive il coinvolgimento di Ambra1a e Ambra1b nello sviluppo del muscolo scheletrico di zebrafish e compara la morfologia di questo tessuto nei morfanti per Ambra1a e Ambra1b e negli embrioni di topo Ambra1gt/gt, nei quali è stato inattivato il gene per Ambra1. In entrambi i casi lo sviluppo del tessuto muscolare è chiaramente compromesso. Fenotipi più gravi vengono ottenuti dal silenziamento dei trascritti materni, sottolineando così il ruolo fondamentale di queste proteine durante le prime fasi dello sviluppo embrionale. Infine, il Capitolo IV descrive il clonaggio e la caratterizzazione di ambra1 nel tunicato Botryllus schlosseri, una specie modello di ascidia coloniale. Si tratta della prima caratterizzazione di trascritti ambra1 in un organismo non-vertebrato. La sequenza amminoacidica dedotta è più corta rispetto alle proteine Ambra1 dei vertebrati, ma contiene sia il dominio WD40, tipico di questa proteina, che altri residui amminoacidici importanti per la poliubiquitinazione e per il taglio proteolitico catalizzato dalle caspasi. La proteina di B. schlosseri è però priva di altri domini importanti quali il motivo di consenso per il legame alla dineina che, nei vertebrati, lega la proteina al suo specifico sito citoscheletrico in assenza di induzione del processo autofagico. L’espressione di questo gene è stata verificata nei diversi stadi del ciclo vitale considerati ed è stata inoltre analizzata mediante microscopia elettronica.