Mechanism of activation and function of the odorant receptor expressed at the axon terminus-growth cone of olfactory sensory neurons

A unique feature in the topographic organization of the olfactory bulb is the “dual role” of the odorant receptor. It detects odorants and it has been suggested to play a critical role in the axonal convergence of olfactory sensory neurons to form glomeruli in specific loci of the olfactory bulb. This spatial segregation of sensory afferents results in the sensory map. A role of the odorant receptors in axon guidance was suggested by genetic experiments demonstrating that manipulations of odorant receptor sequences perturb the sensory map (Wang et al., 1998). This hypothesis was confirmed by subsequent works (Barnea et al., 2004, Strotmann et al., 2004) that revealed the presence of the olfactory receptor in the most distal portion of the axon and at the growth cone. The open question to be addressed was whether the odorant receptor expressed at the axon terminal was functional and if yes, what was the signalling pathway coupled to its activation. In a previous study, Maritan et al., 2009, demonstrated, for the first time, that the odorant receptor expressed at the axon terminus - growth cone is functional and coupled to local increases of Ca2+ and cAMP. Although cAMP and Ca2+ are the primary second messengers produced upon activation of the odorant receptor, cGMP is also synthesized and takes part in several key processes such as adaptation, neuronal development and long term cellular responses to odorant stimulation. Many aspects of the regulation of cGMP in olfactory sensory neurons (OSNs) were still unknown, as the mechanism of coupling to odorant receptors (ORs) and downstream targets. To address these points, we investigated the dynamics and the intracellular distribution of cGMP in living rat OSNs in culture transfected with a genetically encoded sensor for cGMP. We demonstrated that OSNs treated with pharmacological stimuli able to activate particulate or soluble guanylyl cyclases (pGC and sGC) presented an increase in cGMP in the whole neuron, from cilia - dendrite to the axon terminus - growth cone. Upon odorant stimulation, a rise in cGMP was again found in the entire neuron, including the axon terminal, where it is locally synthesized. The odorant - dependent rise in cGMP is due to sGC activation by NO and requires an increase of cAMP. The link between cAMP and NO synthase appears to be the rise in [Ca2+]c elicited by either plasma membrane Ca2+ channel activation and Ca2+ mobilization from stores via the guanine nucleotide exchange factor Epac. Finally we show that a cGMP rise can elicit the phosphorylation of nuclear CREB both in vitro and in vivo. The local synthesis of cGMP, coupled to the OR expressed at the axon terminal, suggested that not only cAMP, but also cGMP can contribute to OSN axonal convergence. The question then arose on the mechanism of activation, i.e. the possible natural ligands, of the olfactory receptor at the axon terminal. We hypothesized that a few molecules expressed in gradient in the olfactory bulb could bind and activate the odorant receptor expressed at the axon terminal, regulating in this way the axon pathfinding to its final target. To test our hypothesis we studied the spatio - temporal dynamics of Ca2+ and cAMP in response to molecules from the bulb. We found that a pool of these molecules is capable of eliciting a rise in Ca2+ and cAMP in the axon terminus - growth cone of OSNs loaded with fura-2 or transfected with the sensor for cAMP. To assess whether the Ca2+ and cAMP rises were due to the activation of the olfactory receptor at the axon terminal, we expressed specific odorant receptors in HEK cells. The Ca2+ rise was observed only in HEK cells transfected with specific receptors, but not in HEK cells transfected with the empty vector (controls). All together, our data demonstrate the presence of a pool of active molecules in the bulb able to activate the OR expressed at the axon terminus - growth cone. To assess the physiological meaning of the variation in Ca2+ and cAMP levels on the turning behaviour of the olfactory sensory neuron axons, real - time imaging experiments on isolated olfactory sensory neurons were performed. We analyzed the behaviour of olfactory sensory neuron growth cone in response to gradients of molecules capable of modulating Ca2+ and cAMP levels at the axon terminus - growth cone, such as forskolin, a generic activator of adenylyl cyclase, odors and the active pool of molecules from the olfactory bulb. We found that all these molecules, including the ones from the bulb, were able to regulate the turning behaviour of the olfactory sensory neuron axons. All together our data suggest that molecules from the olfactory bulb, via activation of the odorant receptor expressed at the axon terminus – growth cone, contribute in providing the olfactory sensory neuron axons with instruction to reach the proper target in the olfactory bulb

Una caratteristica peculiare dell’organizzazione topografica del bulbo olfattivo è il “duplice ruolo” del recettore olfattivo. Esso non solo è in grado di riconoscere gli odori, ma sembra anche svolgere un ruolo chiave nella convergenza assonale dei neuroni sensoriali olfattivi a formare i glomeruli in specifiche posizioni nel bulbo olfattivo. Questa segregazione spaziale delle afferenze assonali porta alla formazione della mappa sensoriale. Un ruolo del recettore olfattivo nei processi di “axon guidance” (orientamento assonale) è stato suggerito da esperimenti genetici (Wang et al., 1998) e successivamente confermato da studi che hanno rivelato la presenza del recettore olfattivo a livello della porzione distale dell’assone e nel cono di crescita (Barnea et al., 2004, Strotmann et al., 2004). La questione che rimane da affrontare è se il recettore olfattivo espresso al cono di crescita sia funzionale e se si, quale sia la cascata di segnalazione intracellulare accoppiata alla sua attivazione. In uno studio precedente, Maritan et al. (2009), hanno dimostrato, per la prima volta, che il recettore olfattivo espresso al cono di crescita è funzionale ed associato a locali incrementi di cAMP e Ca2+. Sebbene l’ cAMP e il Ca2+ siano i principali secondi messaggeri prodotti in seguito all’attivazione del recettore olfattivo, anche il cGMP viene sintetizzato e prende parte a processi quali l’adattamento, lo sviluppo neuronale e le risposte a lungo termine alla stimolazione odorosa. Molti aspetti della regolazione del cGMP nei neuroni sensoriali olfattivi, come il meccanismo di accoppiamento al recettore olfattivo e i “target” a valle, rimangono poco conosciuti. Per far luce su questi punti, abbiamo studiato le dinamiche e la distribuzione intracellulare del cGMP in neuroni sensoriali olfattivi di ratto in coltura transfettati con un sensore per il cGMP geneticamente codificato. Abbiamo dimostrato che neuroni sensoriali olfattivi trattati con stimoli farmacologici capaci di attivare le guanilato ciclasi solubili o di membrana presentavano un incremento del cGMP nell’intero neurone, dalle cilia al cono di crescita. In seguito alla stimolazione con gli odori, un incremento nei livelli di cGMP è stato nuovamente osservato in tutta la cellula, incluso il cono di crescita, dove il cGMP viene localmente prodotto. L’aumento odore - dipendente del cGMP è dovuto all’attivazione della guanilato ciclasi solubile ad opera dell’ossido nitrico (ON) e richiede un aumento di cAMP. Il collegamento tra l’ cAMP e l’ ON sembra essere costituito dall’aumento dei livelli di Ca2+ citosolico indotto sia dall’attivazione dei canali Ca2+ sulla membrana plasmatica, sia dalla mobilitazione del Ca2+ dai depositi intracellulari attraverso lo scambiatore di nucleotidi ciclici Epac. Infine abbiamo dimostrato che l’incremento di cGMP può indurre la fosforilazione di CREB a livello nucleare sia in vitro che in vivo. La sintesi locale di cGMP, accoppiata al recettore olfattivo espresso al cono di crescita, suggerisce che anche questo secondo messaggero, assieme all’ cAMP, può contribuire alla convergenza assonale dei neuroni sensoriali olfattivi. A questo punto ci siamo chiesti quale possa essere il meccanismi di attivazione, in particolare quali possano essere i ligandi del recettore olfattivo espresso al cono di crescita. Abbiamo ipotizzato che alcune molecole, espresse in gradiente nel bulbo olfattivo, possano legare e attivare il recettore olfattivo all’assone terminale. Per testare la nostra ipotesi, abbiamo studiato le dinamiche spazio – temporali di Ca2+ e cAMP in risposta alle molecole estratte dal bulbo olfattivo. I nostri dati dimostrano che un set di molecole è in grado di indurre un aumento di Ca2+ e cAMP nel cono di crescita di neuroni sensoriali olfattivi caricati col fura-2 o transfettati con un sensore per l’ cAMP. Al fine di dimostrare che tali incrementi di Ca2+ e cAMP erano effettivamente dovuti all’attivazione del recettore al cono di crescita, abbiamo espresso specifici recettori olfattivi in cellule HEK. L’aumento di Ca2+ è stato osservato esclusivamente nelle cellule HEK transfettate con diversi recettori olfattivi, ma non in quelle transfettate con il vettore vuoto (mancanti del recettore olfattivo), usate come controllo. Questi dati dimostrano la presenza di un set di molecole attive nel bulbo olfattivo in grado di attivare il recettore espresso al cono di crescita. Per capire il significato fisiologico delle variazioni di Ca2+ e cAMP sul comportamento di “turning” degli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi, abbiamo svolto esperimenti di “real – time imaging” su neuroni sensoriali olfattivi isolati. Abbiamo quindi analizzato il comportamento del cono di crescita in risposta a un gradiente di molecole capaci di modulare Ca2+ e cAMP a livello del cono di crescita, come la forscolina, un attivatore generico delle adenilato ciclasi, gli odori e anche le molecole provenienti dal bulbo olfattivo. Da questi esperimenti emerge che la forskolina, gli odori e anche le molecole del bulbo, sono capaci di regolare il comportamento di “turning” del cono di crescita dei neuroni sensoriali olfattivi. Nel complesso, i nostri dati suggeriscono che alcune molecole del bulbo olfattivo, attraverso l’attivazione del recettore espresso al cono di crescita, contribuiscono a fornire ai neuroni sensoriali olfattivi le informazioni necessarie per raggiungere il corretto bersaglio nel del bulbo olfattivo.