Anticancer activity of liposomal cisplatin in preclinical models of cervical and ovarian cancer

Cisplatin-based chemotherapy improves survival in cervical and ovarian cancer; however, treatment is associated with tumor resistance and significant toxicity. Lipoplatin (Regulon Inc., Mountain View, California) is a liposomal encapsulated form of cisplatin, developed in an effort to reduce cisplatin‟s systemic toxicity, while simultaneously improving the targeting of drugs to primary tumor and metastasis. Lipoplatin has been successfully administered in several randomized Phase II and III clinical trials, but not in cervical and ovarian cancer. The aim of this project was to analyze the antitumoral activity of lipoplatin in cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant cervical and ovarian cancer cells. I evaluated the antiproliferative activity of lipoplatin, with cisplatin as reference drug, in the ME-180 cervical cancer cell line and its cisplatin-resistant clone R-ME-180, and in a panel of ovarian cancer cell lines: A2780, its cisplatin-resistant clone A2780cis, MDAH, OVACR3, OVCAR5, SKOV3, and TOV21G. Results demonstrated that lipoplatin exhibited a potent antitumoral activity in all the tested cell lines, including cisplatin-resistant cells, indicating that there is no cross-resistance between the two drugs. Lipoplatin induced apoptosis, as evaluated by Annexin-V staining and DNA fragmentation. In particular, it induced the mitochondrial apoptotic pathway causing mitochondrial membrane permeabilization, cytochrome-c release, Bcl-2 down-regulation, but Bax up-regulation, and caspases 9 and 3 activation. At the same experimental conditions cisplatin induced apoptosis only in cisplatin-sensitive cells. Moreover, lipoplatin, but not cisplatin, increased reactive oxygen species (ROS) accumulation and inhibited the enzymatic activity of thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme involved in ROS detoxification and over-expressed in many tumor cells contributing to drug resistance. Furthermore, lipoplatin reduced EGFR expression and inhibited both migration and invasion. Multiple drug treatment is widely used in chemotherapy to obtain an additive or a synergistic effect (more than additive). I combined lipoplatin with the chemotherapeutic agents mostly used in ovarian cancer treatment. The results showed that the combination of lipoplatin with doxorubicin or abraxane demonstrated a synergistic effect, whereas the combination of lipoplatin with docetaxel or paclitaxel was less effective or at best additive. In the ascites of ovarian cancer patients there are multicellular aggregates or spheroids that are involved in tumor progression. Thus, spheroid-based assays are more predictive of in vivo therapeutic efficacy because they more closely resemble tumor microenvironment. Furthermore, cancer stem cells (CSC), rare tumor cells involved in initiating cancer growth, drug resistance, and disease recurrence, are also present in spheroids. The treatment with lipoplatin reduced stem cell markers in a dose-dependent manner and inhibited spheroid formation in both cervical and ovarian cancer models. Furthermore, it decreased ovarian cancer spheroid growth, vitality, and migration. Finally, lipoplatin treatment of nude mice with cervical and ovarian tumors significantly inhibited tumor growth in vivo, with low toxicities. Moreover, even after treatment interruption the tumors did not show any regrowth. In conclusion, in this project lipoplatin demonstrated an antitumoral activity in monolayer cultures, three-dimensional spheroids, and in vivo studies using cisplatin-resistant cervical and ovarian cancer cells. These promising results suggest lipoplatin as a novel chemotherapeutic agent for the treatment of cervical and ovarian cancer.

Il cisplatino è uno dei farmaci più utilizzati per il trattamento del carcinoma della cervice e dell‟ovaio. Purtroppo il suo utilizzo in chemioterapia presenta importanti limitazioni, quali l‟elevata tossicità e l‟insorgenza di resistenza intrinseca o acquisita. Il lipoplatino è una formulazione liposomiale del cisplatino (Regulon, Inc., Mt. View, U.S.A), sintetizzata allo scopo di ridurre la tossicità sistemica del cisplatino e contemporaneamente di incrementarne l‟accumulo nel tumore primario e nelle metastasi. Studi clinici di Fase II e III sono stati effettuati in diversi tumori ma non nel carcinoma della cervice uterina e dell‟ovaio. In questo lavoro è stata analizzata l‟attività antitumorale del lipoplatino in modelli preclinici di carcinoma della cervice uterina e carcinoma ovarico sensibili e resistenti al cisplatino. L‟attività antiproliferativa del lipoplatino è stata studiata nella linea cellulare derivata da carcinoma della cervice uterina ME-180 e nel suo clone resistente al cisplatino R-ME-180, come pure in un pannello di linee cellulari derivanti da carcinoma ovarico: A2780, il suo clone cisplatino-resistente A2780cis, MDAH, OVACR3, OVCAR5, SKOV3, e TOV21G. Il cisplatino è stato introdotto nello studio come farmaco di riferimento. I risultati hanno dimostrato che il lipoplatino esibisce una potente attività antitumorale in tutte le linee cellulari analizzate, incluse le cisplatino-resistenti, dimostrando assenza di cross-resistenza con il farmaco cisplatino. Il lipoplatino induce apoptosi, valutata tramite l‟esternalizzazione della fosfatidilserina (marcatore precoce di apoptosi) e la frammentazione del DNA. In particolare, il lipoplatino attiva la via mitocondriale dell'apoptosi, come dimostrato dalla depolarizzazione della membrana mitocondriale, il rilascio del citocromo-c , la diminuzione dell‟espressione della proteina anti-apoptotica Bcl-2, l‟incremento dell‟espressione della molecola pro-apoptotica Bax e l‟attivazione delle caspasi 9 e 3. Nelle stesse condizioni sperimentali il cisplatino attiva l‟apoptosi soltanto in cellule sensibili al cisplatino. L‟enzima tioredoxina reduttasi (TrxR) svolge una funzione ossidoriduttiva proteggendo la cellula da stress ossidativo. Un elevato livello dell‟enzima si osserva in diversi tipi di tumore e sembra essere associato alla resistenza al cisplatino. I miei studi hanno dimostrato che il lipoplatino, ma non il cisplatino, inibisce l‟attività enzimatica della TrxR incrementando la produzione di radicali liberi dell‟ossigeno (ROS). Inoltre il lipoplatino riduce l‟espressione del recettore del fattore di crescita dell‟epidermide (EGFR), un recettore di membrana over-espresso nei tumori, coinvolto nella proliferazione e nella migrazione delle cellule tumorali. Anche la migrazione e l‟invasione cellulare vengono ridotte dal trattamento con lipoplatino. Molto spesso in chemioterapia si somministra una combinazione di più farmaci (polichemioterapia) per ottenere un effetto additivo e/o sinergico. Si è quindi combinato il lipoplatino con i chemioterapici più utilizzati nel trattamento del carcinoma ovarico. La combinazione del lipoplatino con i farmaci doxorubicina e abraxane dimostra effetti sinergici, mentre la combinazione con docetaxel e paclitaxel è meno efficace con effetti quasi additivi. Nell‟ascite di pazienti affette da carcinoma ovarico si possono ritrovare aggregati multicellulari, o sferoidi, che sembrano essere coinvolti nella progressione tumorale. Gli sferoidi rappresentano un valido modello sperimentale con caratteristiche biologiche e molecolari simili ai tumori solidi, tra queste la presenza di cellule staminali cancerose, ossia cellule con grandi capacità rigenerative e di resistenza alle terapie in grado di alimentare la crescita del tumore. Il trattamento con lipoplatino diminuisce in maniera dose-dipendente i marcatori di staminalità e inibisce la formazione di sferoidi in entrambi i modelli sperimentali. Inoltre riduce la dimensione, la vitalità e la disseminazione di sferoidi di carcinoma ovarico. Infine il lipoplatino diminuisce la crescita di tumori xenografi derivanti da cellule di carcinoma della cervice uterina e dell‟ovaio con ridotta tossicità. Anche in seguito all‟interruzione del trattamento i tumori non riprendono la crescita. Concludendo il lipoplatino dimostra un‟attività antitumorale in colture cellulari tradizionali, in colture tridimensionali o sferoidi ed in vivo, sia di cellule derivanti da carcinoma della cervice uterina cisplatino-resistenti che da carcinoma ovarico. Questi risultati molto promettenti suggeriscono un potenziale utilizzo di questa formulazione liposomiale di cisplatino per il trattamento di pazienti affette dalle suddette patologie.