Protein kinase CK2: analysis of its role in acute myeloid leukemia and conditional KO in mouse hematopoiesis

Hematopoiesis is a tightly controlled, hierarchically organized developmental process whereby hematopoietic stem cells (HSC) give rise to highly specialized, differentiated blood cells. HSC are characterized by the capacity of both self-renewing and differentiating in downstream committed hematopoietic progenitor cells. In vertebrates, hematopoiesis in embryonic and fetal life occurs in primitive hematopoietic organs whereas in the adult organism the definitive site of blood cell production is the bone marrow (BM). HSC are quiescent cells that reside most of the time in G0-G1 phases of the cell cycle, dividing during their lifespan as much as it is needed to maintain their own pool and give rise to committed precursors. Leukemia formation is characterized by the block of this process and accumulation of immature cells in the bone marrow and peripheral blood. In particular, acute myeloid leukaemia (AML) is characterized by the accumulation of large numbers of abnormal cells that fail to differentiate into functional mature blood cells. Leukemic blasts have a limited, exhaustible proliferative potential, suggesting that, in order to maintain leukemia growth, a small subpopulation of leukemic stem cells (LSCs) must display an inexhaustible proliferative capacity and self-renewal potential. No definitive proof of LSCs was available, however, until Dick and colleagues showed that the engraftment of NOD/SCID mice with primary AML samples could only be accomplished using cells that were phenotypically similar to normal hematopoietic stem cells (HSCs) by expressing CD34 and lacking markers of lineage commitment such as CD38 . HSCs and LSCs share common features: self-renewal, the capacity to differentiate, resistance to apoptosis, and limitless proliferative potential. The pathway regulating these functional properties can be categorized into self-renewal, developmental, and miscellaneous pathways, each of which is governed by a distinct set of critical genes that have emerged from molecular profiling and can be associated with stemness. In particular Wingless (Wnt)/β catenin and PI3K/AKT pathways are crucial for the control of both HSCs and LSCs biology, because they regulate proliferation, self renewal and differentiation of HSCs and they are involved in maintenance of LSCs. Phosphorylation is one of the molecular mechanism responsible for the signal transduction modulation of these two pathways and some molecules belonging to these pathways are phosphorylated by serin-threonin kinase CK2. Thus, this protein can have an important role in the biology of both HSCs and LSCs. CK2 is a pleiotropic and constitutive activated kinase, which has a tetrameric structure composed by two alpha catalytic subunits and two beta regulatory subunits, but these two components can work also separately. CK2 is essential for cell survival and proliferation, and is more and more evident its involvement in various aspects of tumor transformation. High levels of CK2 are found in different tumor type such as breast, lung, kidney cancer and also blood cancer. CK2 promotes the activity of proto-oncogenes (c-myc, C-Jun, A-Raf), drives cell cycle progression, stimulates beta-catenin activity, inhibits the onco-suppressors p53, PML and PTEN, and it can exert an anti-apoptotic effect through the inhibition of caspase activity. For this reasons, the principal aim of our research project is obtaining experimental evidence of a role of CK2 in normal hematopoiesis and in LSCs through the analysis of AML cell lines and samples collected from patients, and of a conditional knockout mouse model for CK2β in the hematopoietic system. As far as the role of CK2 in the hematopoiesis is concerned, our conditional KO mouse model for CK2β in the hematopoietic compartment, demonstrate that the regulatory subunit of CK2 has an important role in hematopoiesis. In particular, the KO of CK2β induces an impairment in hematopoiesis, especially in erythropoiesis. However, CK2β KO seems not to influence the HSCs pool but instead the hematopoietic progenitors. As far as the analysis of LSCs from AML samples, our analysis performed both on AML samples derive from patients and on Kasumi-1 cell line demonstrated that CK2 does not affect the Wnt/ β catenin and HH pathways, whereas it is able to modulate the PI3K/AKT pathway. Moreover, we have demonstrated that CK2 is important in LSCs survival as its inhibition increases the apoptosis and potentiates the effects of Daunorubicin, a drug currently used for AML treatment in clinic. Taken together, all our results indicate that CK2 possesses an important role both in hematopoiesis and in the biology of LSCs.

L'ematopoiesi è un processo fisiologico, finemente e strettamente controllato, attraverso il quale si ha la produzione di tutte le cellule mature del sangue a partire da una piccola popolazione di cellule staminali, denominate cellule staminali ematopoietiche (HSC). Le HSC si caratterizzano per la loro capacità di auto-rinnovarsi e di differenziare in cellule progenitrici maggiormente differenziate. Nei vertebrati, l'ematopoiesi viene suddivisa in primitiva e definitiva: la prima avviene negli organi ematopoietici primitivi, mentre la seconda risiede nel midollo osseo delle ossa lunghe. Le HSC sono cellule quiescenti, che per la maggior parte della loro vita si trovano nello stadio G0/G1 del ciclo cellulare, dividendosi solamente lo stretto necessario per auto mantenersi e per dare origine ai progenitori in grado poi di differenziare nelle cellule ematiche mature. La formazione di una leucemia è caratterizzata dal blocco di questo processo e dall'accumulo di cellule immature nel midollo osseo e nel sangue periferico. In particolare la leucemia mieloide acuta (AML) si caratterizza per l'accumulo di un gran numero di cellule anomale (blasti) incapaci di completare il processo di differenziamento in cellule mature del sangue. I blasti leucemici si caratterizzano per la loro limitata capacità proliferativa, e questo suggerisce che, per mantenere la crescita del clone leucemico, sia necessaria la presenza di una piccola popolazione di cellule in grado di auto rinnovarsi e proliferare. Questa popolazione viene definita come cellule staminali leucemiche (LSC). La prova definitiva dell'esistenza delle LSC è stata fornita dagli studi condotti da Jonh Dick e colleghi in un modello di xenotrapianto in topi NOD/SCID, nei quali venivano introdotte cellule derivate da pazienti affetti da AML e aventi un fenotipo simile alle HSC normali (queste cellule infatti esprimono sulla loro superficie il marcatore CD34 ma mancano del marker CD38 e di tutti i marcatori di linea, come le cellule staminali ematopoietiche normali). HSC e LSC posseggono caratteristiche comuni, quali la capacità di auto- rinnovarsi (self-renewal), di differenziare, di resistere all'apoptosi e un potenziale di proliferazione illimitato. Tutte queste proprietà funzionali sono regolate a livello molecolare da molteplici vie del segnale, che vengono generalmente raggruppate nelle seguenti categorie: vie del segnale del self-renewal, dello sviluppo e miscellanei, ciascuno dei quali è controllato da un set distinto di geni il cui ruolo nel controllo e mantenimento della staminalità è stato determinato con una serie di studi di profiling molecolare. Tra queste vie del segnale, le vie di Wnt/ β catenina, Hedgehog e PI3K/AKT posseggono un ruolo cruciale nel controllo della biologia sia delle LSC che delle HSC, dato che sono coinvolte nella regolazione dei processi di proliferazione, auto rinnovamento e differenziamento. Uno dei meccanismi molecolari responsabile della modulazione della trasduzione del segnale di queste vie è la fosforilazione, e alcune molecole appartenenti a queste vie sono fosforilate dalla proteina chinasi CK2. Quindi questa proteina potrebbe rivestire un ruolo importante nella biologia sia delle HSC e delle LSC. CK2 è una serin- treonin chinasi pleiotropica e costitutivamente attiva, che possiede una struttura tetramerica, composta da due subunità α ad attività catalitica e da due subunità β con attività regolatoria, ma questi due componenti possono lavorare anche indipendentemente l'una dall'altra. CK2 è essenziale per la sopravvivenza cellulare e proliferazione, ed è sempre più evidente il suo coinvolgimento in vari aspetti della formazione neoplastica. Infatti, elevati livelli di CK2 sono stati riscontrati in vari tipi di tumore, come il tumore al seno, al polmone, al rene ed ematologici. CK2 infatti promuove l'attività di proto-oncogeni (c-myc, C-Jun, A-Raf), regola la progressione del ciclo cellulare, stimola l'attività di β catenina , inibisce gli onco-soppressori p53, PML e PTEN e può esercitare un effetto anti-apoptotico attraverso l'inibizione delle caspasi. Con il presente progetto di dottorato abbiamo pertanto cercato di ottenere prove sperimentali del ruolo svolto da CK2 sia nell'ematopoiesi normale, mediante lo studio di un modello murino di KO condizionale di CK2β nel tessuto ematopoietico, che nella condizione patologica di leucemia mieloide acuta, mediante lo studio di 10 casi di pazienti affetti da AML e con l'ausilio della linea cellulare Kasumi-1. Per quanto concerne lo studio del ruolo di CK2 nell'ematopoiesi normale, il nostro modello di KO condizionale per CK2β nell'intero sistema ematopoietico ci ha permesso di determinare il ruolo fondamentale che tale proteina riveste in tale processo. In particolare il KO per CK2β ha un fenotipo letale, in quanto la mancanza di CK2β causa un grave deficit dell'ematopoiesi, in particolare nel processo di eritropoiesi. Tuttavia, Tra le popolazioni analizzate solo i progenitori ematopoietici sembrano risentire del KO di CK2β, mentre le HSC non sembrano subire alterazioni nei topi KO. Per quanto riguarda invece lo studio del ruolo di CK2 nelle cellule staminali leucemiche, l'analisi affettuata sia su campioni prelevati da pazienti affetti da LMA che sulla linea cellulare Kasumi-1 ha evidenziato come CK2 sia in grado di modulare l'attività della via del segnale di PI3K/AKT, mentre le vie di Hedgehog e Wnt/ β catenina non sembrano influenzate in modo rilevante da CK2. Inoltre, studi condotti combiando l'inibitore di CK2, CX-4945, da solo o in combinazione con Daunorubicina (un chemioterapico correntemente usato nella terapia della LMA), ha evidenziato come la mancanza dell'attività di CK2, non solo aumenti il tasso di apoptosi nelle LSC ma sia in grado di potenziare l'effetto citotossico della Daunorubicina, rendendole maggiormente sensibili all'azione del farmaco. Concludendo, i risultati elencati sopra dimostrano come CK2 possegga un ruolo essenziale sia nell'ematopoiesi che nella biologia delle LSC.