Development and validation of methods for genome-wide epigenetic analyses of human myogenic cells

Epigenetics is subjected to a pressing attention from the scientific community, because of its potential to explain the mechanisms of gene activation or repression. In this thesis I present a discovery-driven project aimed to the investigation of the epigenetic role in human myogenesis (and in particular the differentiation of myoblasts in myotubes). Studying epigenetics still presents significant hurdles, both experimental and computational. Therefore my first task was the establishment of robust protocols for investigating the role of epigenetics players during skeletal muscle differentiation. In particular, I focused on setting up the tools for studying DNA methylation and protein-DNA interactions, through bisulfite sequencing and chromatin immunoprecipitation. In this thesis, together with the description of the protocols that I developed, I report the first results that were obtained on myogenic cells. DNA methylation was investigated with bisulfite treatment of the DNA coupled with next generation sequencing. A novel method for studying the whole methylome was conceived and applied on one myoblast sample using SOLiD 5500xl platform giving reliable results. However, since the cost of methylome sequencing is still very high, instead of producing data for the whole methylome, I decided to focus on selected regions that could be relevant in methylation studies. For this reason I used the SureSelect MethylSeq Target Enrichment kit (Agilent) that effectively captures more than 2,700,000 CpG sites in the human genome. We identified less than 600 differentially methylated sites (DMS) in myoblasts compared to myotubes, however we observed that the activation of muscle specific genes seem to be poorly correlated with DNA methylation changes. Therefore, we argue that DNA methylation does not show a major role in the control of muscle specific genes. Interestingly, further analysis revealed that a high percentage of differentially methylated regions (DMR) localizes near novel non-coding RNA genes. On the one hand, this observation suggests a role for novel regulatory RNAs in the epigenetics of muscle differentiation; on the other hand, DNA methylation might have a role in the regulation of these RNAs. Together with DNA methylation, chromatin compaction is a major epigenetics player. In order to describe the epigenetic landscape of muscle differentiation, I optimized the ChIP-seq approach to define the localization of specific histone modifications on DNA. After setting-up the protocol for ChIP-seq, H3K4me3, H3K27me3 and H3K9ac histone modifications were mapped on myoblast DNA. As I started integrating gene expression and ChIP-seq data, I verified that a great concordance exists between gene expression and ChIP-seq results. In particular, euchromatin-associated histone modifications are found in transcription start sites of active genes, and heterochromatic signature spans promoters and bodies of inactive genes. Further investigation show that genes for non-coding RNAs have an euchromatic signature. This observation, together with the findings of DMRs in novel non-coding RNA genes, endorses the hypothesis of a role for novel regulatory RNAs in myogenic differentiation. In conclusion, the integration of BS-seq, ChIP-seq and RNA-seq data are opening interesting scenarios concerning the involvement of regulatory RNAs, while recent reports are suggesting to extend our investigation even to DNA hydroxymethylation in the epigenetics of muscle differentiation.

Negli ultimi anni l’epigenetica ha raccolto un sempre crescente interesse da parte della comunità scientifica, grazie al suo potenziale di spiegare i meccanismi di attivazione e repressione dell’espressione genica. In questa tesi si presentano i risultati di un progetto di analisi del ruolo dell’epigenetica nella miogenesi umana, mediante approcci genomici. Gli studi di epigenetica presentano tuttora ostacoli significativi, sia dal punto di vista sperimentale che di analisi computazionale del dato prodotto. Il mio primo obiettivo è stato quindi la messa a punto di un protocolli robusti per l’analisi del ruolo dei meccanismi epigenetici durante il differenziamento del muscolo scheletrico, in particolare la metilazione del DNA e le interazioni DNA-proteine (mediante il sequenziamento di DNA trattato con bisulfito e immunoprecipitazione della cromatina). In questa tesi, oltre alla descrizione dei protocolli sviluppati, sono riportati i primi risultati ottenuti applicando i suddetti protocolli alle cellule miogeniche. La metilazione è stata analizzata mediante trattamento con bisulfito del DNA, sequenziato successivamente con tecniche di nuova generazione (NGS). A tal riguardo è stato messo a punto un nuovo metodo per lo studio del metiloma intero, che è stato applicato ad un campione di mioblasti e successivamente sequenziato con la piattaforma SOLiD 5500xl. Questo approccio richiede tuttavia una quantità massiva di sequenze, che ad oggi risultano ancora eccessivamente costose. È stato quindi affiancato allo studio del metiloma il sequenziamento delle regioni più comunemente analizzate in studi di metilazione (ovvero regioni promotoriali ed isole CpG) con un kit di arricchimento di regioni target che cattura selettivamente più di 2.700.000 siti CpG nel genoma umano. Con questo approccio sono stati identificati meno di 600 siti differenzialmente metilati (DMS) nei mioblasti confrontati con i miotubi. Questo studio ha permesso di osservare che l’attivazione di geni muscolari sembra poco correlata con cambiamenti nella metilazione del DNA, permettendo di ipotizzare che la metilazione del DNA non abbia un ruolo centrale nel controllo dell’attivazione dei geni muscolo-specifici. L’analisi di questi dati ha inoltre permesso di rilevare che una significativa frazione di regioni differenzialmente metilate (DMR) localizza in prossimità di geni codificanti non-coding RNA. Da un lato quest’osservazione suggerisce che gli RNA regolatori potrebber avere un ruolo nell’epigenetica nel differenziamento muscolare, e inoltre che la metilazione del DNA potrebbe avere un ruolo nella regolazione di questi RNA. Un altro aspetto importante della regolazione epigenetica, oltre alla metilazione del DNA, è lo stato di condensazione della cromatina. Per vagliarne il contributo nell’ambito del differenziamento muscolare, è stato ottimizzato un approccio di immunoprecipitazione della cromatina seguito dal sequenziamento (ChIP-Seq) per definire la localizzazione nel DNA di specifiche modificazioni istoniche: H3K4me3, H3K27me3 and H3K9ac. I risultati di questi esperimenti di ChIP-Seq sono stati confrontati con quelli di analisi del profilo di espressione (RNA-Seq), permettendo di verificare un ampio margine di sovrapposizione fra il livello di espressione ed i risultati di ChIP-Seq. In particolare le modificazioni istoniche associate all’eucromatina localizzano nei pressi del sito di inizio di trascrizione di geni espressi, mentre i marker di eterocromatina fiancheggiano i promotori dei geni non attivi. Questa osservazione, assieme all’osservazione di DMR in nuovi RNA non codificanti, supporta l’ipotesi di un ruolo per nuovi circuiti regolatori di RNA nel differenziamento miogenic.