Role of FOXM1 and FOXO3a in B-lymphoblastic leukaemia progression and glucocorticoid responsiveness

B-cell acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL) is one of the most common paediatric disorders characterized by an accumulation of B-cell blasts reminiscent of normal stages of differentiation and by infiltration of various extramedullary sites. B-ALL patients that respond poorly to glucocorticoid therapy when diagnosed are usually predicted to undergo relapse. Therefore understanding the biological mechanisms underlying this poor responsiveness is crucial for the development of more effective therapies. FOXM1 belongs to the Forkhead Box (FOX) superfamily of transcriptional factors and is a major regulator of cell proliferation and cell cycle progression. Its expression increases at the entry of cell cycle S-phase, remains stable during G2/M phase, and finally, is degraded at the mitotic exit. FOXM1 is a bona fide proto-oncogene and its up-regulation is often associated with a high proliferation rate, resistance to drugs and poor prognosis of many tumours, as well as with the development and progression of many malignancies. Therefore, downregulation of FOXM1 expression and activity might be a key strategy to inhibit tumour progression. In the first study we investigated the potential role of FOXM1 in B-ALL cell proliferation, aiming to understand if FOXM1 can be targeted to either increase the efficiency of chemotherapeutic treatment, or to overcome drug resistance in this haematological malignancy. We observed that FOXM1 protein and mRNA levels are higher in B-ALL patients and cell lines when compared to lymphocytes of healthy donors (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs). We then downregulated FOXM1 in REH and NALM-6 cell lines using a specific FOXM1 siRNA or thiostrepton treatment: there was a significant reduction in cell proliferation, cell cycle arrest in G2/M and an increase in sub-G1 cells. Importantly, we observed that thiostrepton acts in synergy with conventional chemotherapeutic agents, increasing their efficiency and partially reversing the glucocorticoid resistance in REH cells. Altogether, our results suggest that FOXM1 inhibition could be a useful strategy to increase the efficacy of existing therapeutics for B-ALL and to overcome drug resistance. In the second study we focused our attention on another FOX family member: the transcription factor FOXO3a. Although FOXO3a is mainly described as a bona fide tumour suppressor, literature reveals that it might also play a role as a proto-oncogene, by inducing cancer development and drug resistance according to the cellular context. FOXO3a transcriptional activity is regulated by a complex array of post-translational modifications. Amongst there, phosphorylation and acetylation are the major regulators of FOXO3a subcellular localization and transcriptional function. In this work, we investigated whether FOXO3a is involved in dexamethasone responsiveness of B-lymphoblastic leukaemia (B-ALL). Western blot and immunostaining data showed that FOXO3a becomes active only in sensitive cells following dexamethasone treatment. In dexamethasone sensitive cells (RS4;11 and SUP-B15), FOXO3a translocates from the cytoplasm to the nucleus, where it induces the expression of BIM, p27 and the activation of apoptosis signature through caspase-3 cleavage. Moreover knockdown experiments clearly reveal that FOXO3a expression and function is fundamental for dexamethasone mediated cytotoxicity. We then performed a series of experiments to clarify if its activity is regulated by phosphorylation and/or acetylation. More importantly, two post-translational modifications, phosphorylation on Ser7 and acetylation on Lys242 and Lys245, appeared to be crucial for dexamethasone-mediated FOXO3a activation in sensitive cells. Clarifying which are the biological processes that prevent these post-translational modifications from occurring in dexamethasone-resistant REH cells, might pave the way to overcoming glucocorticoid resistance in B-ALL

La leucemia linfoblastica acuta di tipo B (B-ALL) è un tumore caratterizzato dall’accumulo nel midollo osseo di linfociti immaturi, blasti, di tipo B che successivamente invadono il sangue, raggiungendo anche i linfonodi, la milza, il fegato e il sistema nervoso centrale. I pazienti B-ALL che alla diagnosi non rispondono al trattamento con glucocorticoidi, sono spesso soggetti a prognosi infausta e a ricaduta della malattia. Comprendere quindi quali siano i meccanismi molecolari sottostanti a questa resistenza ai glucocorticoidi permetterebbe di evitare fenomeni di ricaduta e potenzialmente di trovare nuove efficaci terapie antitumorali. FOXO3a e FOXM1 appartengono alla stessa famiglia di fattori di trascrizione denominati forkhead. Sebbene non sia ancora stato chiarificato quale sia il ruolo svolto da questi due fattori di trascrizione nelle B-ALL, i lavori riportati in letteratura dimostrano che FOXO3a e FOXM1 generalmente svolgono ruoli opposti all’interno della cellula. FOXM1 infatti è un importante oncogene che regola principalmente la proliferazione cellulare promuovendo la progressione tumorale. Per questo motivo, FOXM1 è spesso sovraespresso in diversi tipi di tumori, contribuendo quindi alla resistenza terapeutica e alla progressione tumorale. FOXO3a al contrario è un noto soppressore tumorale la cui attivazione è fondamentale per favorire la citotossicità di molti composti chemioterapici. Tuttavia la sua localizzazione intracellulare ed attività trascrizionale sono regolate da una complicata rete di modificazioni post-traslazionali, quali la fosforilazione, l’acetilazione, la metilazione e l’ ubiquitinazione. Nella prima parte di questo studio abbiamo quindi esaminato se questi due fattori di trascrizione, FOXO3a e FOXM1, svolgono un ruolo nelle B-ALL. In particolare abbiamo analizzato se FOXM1 è coinvolto nella proliferazione cellulare e nella risposta al trattamento chemioterapico. Inoltre abbiamo svolto una serie di esperimenti per comprendere se FOXO3a è coinvolto nella risposta al trattamento coi glucocorticoidi (desametasone) e se la sua attività trascrizionale viene modulata da modificazioni post transazionali quali la fosforilazione e l'acetilazione. I dati ottenuti hanno dimostrato che entrambi i fattori di trascrizione, FOXM1 e FOXO3a svolgono un ruolo chiave nelle leucemie B-ALL. FOXM1 è un importante regolatore della proliferazione tumorale, infatti la sua downregolazione provoca una significativa diminuzione della proliferazione cellulare associata all’arresto del ciclo cellulare in G2/M. FOXM1 inoltre risulta essere un importante target terapeutico per le B-ALL in quanto la sua inibizione può significativamente incrementare l’effetto citotossico dei chemioterapici che sono normalmente utilizzati per trattare i pazienti affetti da B-ALL. Il fattore di trascrizione FOXO3a gioca un ruolo centrale nel mediare la risposta al trattamento con desametasone. Infatti, in seguito al trattamento, FOXO3a diventa trascrizionalmente attivo solo nelle cellule che sono sensibili (RS4;11 e SUP-B15). FOXO3a trasloca nel nucleo dove regola l’espressione di geni proapoptotici. Diversamente nelle cellule resistenti al desametasone, REH, FOXO3a rimane inattivo e localizzato nel citoplasma. Inoltre, FOXO3a diventa maggiormente fosforilato e acetilato, nei siti Ser7 e Lys242/245 rispettivamente, solo nelle cellule sensibili, suggerendo che probabilmente queste due modificazioni post-translazionali contribuiscono nel promuovere la sua attivazione trascrizionale. Nella seconda parte dello studio ho analizzato il meccanismo molecolare di due classi di composti antitumorali, gli arilamino triazoli e le fenilcinammidi, entrambi sintetizzati per inibire, in maniera selettiva, la proliferazione ed indurre morte cellulare nelle cellule tumorali. In particolare, è stato studiato l'effetto di tali molecole sulla polimerizzazione della tubulina, sul ciclo cellulare e sull'attivazione dell'apoptosi per la delucidazione di un possibile meccanismo d'azione. I composti testati hanno mostrato attività antiproliferativa comparabile o superiore rispetto ai composti di riferimento. Per quanto riguarda il meccanismo d'azione, in generale, entrambi questi composti inducono un blocco del ciclo cellulare in fase G2/M il quale porta all'attivazione del processo apoptotico caspasi- dipendente. Tuttavia gli arilamino triazoli agiscono principalmente come inibitori della polimerizzazione della tubulina, mentre le fenilcinammidi agiscono riducendo significativamente i livelli di antiossidante intracellulare glutatione, provocando quindi un aumento dello stress ossidativo intracellulare che in ultima analisi porta ad apoptosi