La metabolomica: nuovo approccio alla medicina predittiva per il bambino e il neonato

BACKGROUND Metabolomics is an emerging science, with promising application in medical practice. The metabolomic approach is based on the global identification, not driven by a priori hypothesis, of a high number of metabolites in a biological fluid; this allows the characterization of the metabolic profile typical of a certain condition, permitting to identify which metabolites or pattern of metabolites could be useful in discriminating different groups of subjects. By analysis of spectroscopic data, multivariate statistical analysis tools allow you to extract data relevant metabolic characterization of specific physiological and patho-physiological. Furthermore, the analysis needs metabolomics low amounts of biological sample, a feature that makes it applicable to multiple arrays but which especially makes it easy to use in the paediatric field. The impact of this science in the field of maternal and child studies is very important, to investigate whether there are metabolites useful to diagnose some of the most widespread diseases in childhood and to investigate whether there are correlations between the maternal condition and the development of diseases in the newborn. In the specific case we applied the metabolomic approach to some of the most common diseases of the scope for Childcare: food allergy, the preterm delivery, the development of BPD and defects of the β-oxidation of fatty acids. OBJECTIVES The aim of my PhD was to apply metabolomics analysis and mass spectrometry to investigate some of the most common diseases of children and maternal field (food allergy, pre-term birth, BPD development and defects of the β-oxidation of fatty acids) using different biological matrices: urine, amniotic fluid, plasma and blood spot. Two different approaches were applied: a target approach, very specific, that focuses on the qualitative and quantitative analysis of a single analyte, such as a marker disease or the substrate of an enzyme reaction; an untargeted approach (fongerprinting) focused on the analysis of a group of metabolites belonging to a specific metabolic pathway or a class of compounds. METHODS The untargeted approach was applied to two studies: the first to see on a group of children with suspected milk allergy to differentiate the allergic reaction in urine samples taken before the outbreak; the second to evaluate the metabolic profiles of amniotic fluid of patients with preterm delivery and development of BPD in order to be able to predict preterm birth and development of BPD in the child. The first is a prospective study including 30 children (19 males and 11 females, average age 4 years; they were all affected by IgE mediated cow’s milk protein allergy). The patients submitted to a milk oral challenge test and, accordingly, were divided in two groups: positives (15 children) and negatives (15 children). A urine sample was collected for each patient before the milk challenge test. The second is a pilot study including 32 infants of mothers who had undergone amniocentesis between the 21st and the 28th week of gestation have been included in the study: 10 preterm infants with BPD (A), 11 healthy preterm infants without BPD (B), and 11 healthy term infants (C). The metabolomic analysis of the urine and amniotic fluid was performed by means of Q-Tof (Synapt G2; Waters) high performance mass spectrometry platform coupled with a UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography, Waters) system, characterized by a high chromatographic resolution and a short analytic time. The sample were analysed by means of two different types of chromatographic columns (one column, HSS T3, with a reversed phase; the other with a polar phase, ACQUITY BEH HILIC). For each column the sample were analysed in positive and negative polarity. The results of the LC-MS analysis were processed with the MarkerLynx software and submitted to multivariate statistics methods. The variables which emerged from the statistic analysis were then confronted with the variables in the databases on the internet (HMDB and Metlin). As far as the targeted approach is concerned, it was applied to the study of the metabolism of the fatty acids during β-oxidation. 157 newborn children were taken into consideration, and they were divided in four groups, according to the gestational age (SG): group 1 (22-27 +6 SG); group 2 (28-31 +6 SG) group 3 (32-36 +6 SG) group 4 (37-41 +6 SG). 48-72 hours after birth, DBS (blood spot on blotting paper) and plasma samples were collected from each subject. For the analysis, unmarked acylcarnitine donated by Dr. Piero Rinaldo (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) were used, together with stable isotopes marked compositions, purchased from the ChromSystems Instruments & Chemicals (Munich, Germany), which were used as internal standards. The acetonitrile, the methanol, and the n-butanol were purchased from Carlo Erba (Milan, Italy); the trifluoroacetic acid (TFA) and the acetyl chloride from the Sigma-Aldrich (Milan, Italy). All the solvents were chromatographically pure. In order to quantify the acylcarnitine, calibration curves were built for each of them by the isotopic dilution method. For the statistic analysis the STATISTICA 6.0 (Stat Soft Inc, Tulsa, USA) and SPSS for Windows (version 21.0, IBM Corp., Armonk, NY) software packs were used. RESULTS The study on the prediction of the pre-term delivery and the BPD development based on the analysis of the amniotic fluid had led to the development of two data sets. The analysis of these two sets (one for each ionization method applied during the spectroscopic analysis) has allowed us to build two robust PLS-DA (Partial Least Square regression-Discriminant Analysis) models (R2=0.78 and Q2=0.56; R2=0.80 and Q2=0.56), which are able to clearly discriminate the AF samples belonging to the three groups of infants (A,B,C). A preliminary data analysis through PCA (Principal Component Analysis) had permitted to exclude the hypothesis that this discrimination could be due to the confounding effect of some important clinical variables (mother age at amniocentesis, gestational age at amniocentesis and therapy the mother submitted to during pregnancy). Last, in the study of the acylcarnitine and the amino acids, the reported results define the normal range of concentrations of the carnitine pool components, including isomers and isobaric metabolites in plasma and DBS samples, for infants of different gestational ages. The values obtained from the analysis of the samples do not fit a Gaussian distribution, therefore medians and percentiles (10°, 25°, 75°, 90°) of the concentrations of each metabolite were calculated for each group (G1, G2, G3, G4). We have also carried out the statistical analysis of the differences between the different groups. CONCLUSION The two untargeted studies have demonstrated that the metabolomic analysis is able to predict the milk oral challenge test response, on the basis of the urine metabolomic profile, and to predict pre-term birth and BPD development through the analysis of amniotic fluid. Especially as far as food allergy is concerned, 4 variables have emerged as particularly relevant in the differentiation of the two groups. Despite the fact that the confrontation of the chemical-physical characteristics of these variable with the metabolomic databases has not allowed the identification of the exact nature of the variables, it is worth underlining that the use of 2 of the most important identified variables leads to the creation of a decisional tree which allows the correct prediction in response to the test in all the subjects but one. Nevertheless, regardless of the complete identification of the involved metabolites, the most relevant result is the existence of a “metabolic fingerprint” that individuates children with higher risk of positive response to challenge test. The development and the validation of this method will allow us to avoid submitting to the oral challenge test children who are highly at risk of developing a generalized (systemic) allergic reaction. The study on the amniotic fluids had demonstrated that the metabolic profile of the amniotic fluid collected between the 21st and the 28th pregnancy week can discriminate the pregnancies subject to a pre-term delivery from those subject to an on term delivery, and identify the newborn children who will develop a BPD. These results support the hypothesis that some prenatal metabolic alterations may have a key role in the pre-term birth and in the development of BPD in the newborn. Nevertheless, further studies are necessary in order to confirm these preliminary results and to explain the interaction between the maternal-fetal environment and the development of BPD in the newborn. The results of the analysis of the acylcarnitine and the amino acids profile confirm the necessity to define specific normal intervals for every matrix and for each group of different gestational age; moreover, the comparison with results obtained by other Authors reveals the importance that each laboratory have its own reference values, both for diagnostic and research purposes. The use of HPLC-MS/MS method has allowed to complete the carnitine analysis in pre-term and on term newborn children, allowing for the first time the simultaneous analysis of more than 40 acylcarnitines, including some isomeric and isobaric forms. These characteristics and the obtained results make this test suitable for diagnostic purposes, such as second-tier test for expanded newborn screening

PRESUPPOSTI DELLO STUDIO La metabolomica è una scienza emergente, con promettenti applicazioni in campo medico. L’approccio metabolomico si basa sull’identificazione globale, non guidata da ipotesi a priori, di un elevato numero di metaboliti presenti in un fluido biologico; questo consente di caratterizzare il profilo metabolico di una determinata condizione e permette di identificare quali metaboliti o pattern di metaboliti possono essere utili nella discriminazione tra differenti gruppi di studio. Mediante l’analisi dei dati di spettroscopia e strumenti di analisi statistica multivariata consentono di estrapolare i dati metabolici rilevanti nella caratterizzazione di specifici stati fisiologici e pato-fisiologici. Inoltre, l’analisi metabolomica necessità di basse quantità di campione biologico, caratteristica che la rende applicabile a molteplici matrici ma che soprattutto la rende facilmente utilizzabile in ambito pediatrico. L’impatto di tale scienza nel campo degli studi materno-infantili è molto importante, sia per indagare se esistano metaboliti utili a diagnosticare alcune delle patologie maggiormente diffuse in età infantile sia per indagare se esistano delle correlazioni tra la condizione materna e lo sviluppo di malattie nel neonato. Nel caso specifico abbiamo applicato l’approccio metabolomico ad alcune delle più diffuse patologie dell’ambito materno infantile: l’allergia alimentare, il parto pre-termine, lo sviluppo di BPD e i difetti della β-ossidazione degli acidi grassi. SCOPO DELLO STUDIO Lo scopo del dottorato è stato quello di applicare l’analisi metabolomica basata sulla spettrometria di massa a diverse patologie che interessano l’ambito materno-infantile (allergie, parto pretermine in relazione allo sviluppo di BPD e al metabolismo degli acidi grassi attraverso la beta ossidazione) utilizzando diverse matrici biologiche: urine, liquido amniotico, plasma e spot di sangue. Si è proceduto all’applicazione di due diversi approcci: uno di tipo target, altamente specifico, che si focalizza sull’analisi qualitativa e quantitativa di un singolo analita, come un marcatore di malattia o il substrato di una reazione enzimatica; e uno di tipo untarget (fingerprinting) focalizzato sull’analisi di un gruppo di metaboliti appartenenti a una specifica via metabolica o una certa classe di composti. MATERIALI E METODI Per quanto riguarda l’approccio untarget questo è stato applicato a due studi: il primo mirato a vedere su una coorte di bambini con presunta allergia al latte se si potesse differenziare la reazione allergica in campioni di urine prelevate prima dello scatenamento; il secondo a valutare i profili metabolici di liquidi amniotici di pazienti con parto pretermine e sviluppo di BPD al fine di riuscire a predire la prematurità del parto e lo sviluppo di BPD nel bambino. Per il primo studio sono stati reclutati 30 bambini, di cui 19 maschi e 11 femmine, di età media pari a 4 anni affetti da allergia alle proteine del latte vaccino IgE mediata. I pazienti sono stati sottoposti a test di provocazione orale con latte ed in base all’esito del test, sono stati suddivisi in due gruppi: pazienti con risposta positiva (15 bambini) e i pazienti con risposta negativa (15 bambini). Un campione di urina è stato raccolto prima dell’esecuzione del test di provocazione; i campioni sono stati poi sottoposti ad analisi metabolomica basata su spettrometria di massa associata a cromatografia UPLC. Nel secondo caso si tratta di uno studio retrospettivo e trasversale che includeva 32 bambini nati da madri che avevano subito l'amniocentesi tra la 21° e la 28° settimana di gravidanza, e 12 bambini sani nati a termine attraverso il taglio cesareo da madri il cui campione di liquido amniotico era stato raccolto al momento del parto. I bambini sono stati poi suddivisi in tre gruppi differenti: A) neonati pretermine con BPD; B) neonati prematuri senza BPD e C) bambini nati a termine e senza sviluppo di BPD. L'analisi dei campioni di urina e liquido amniotico è stata eseguita tramite uno spettrometro di massa Q-Tof (Synapt G2; Waters) ad alta risoluzione interfacciato con un sistema cromatografico UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography) (Waters) caratterizzato da un’elevata risoluzione cromatografica e da un breve tempo analitico. I campioni sono stati analizzati utilizzando due diversi tipi di colonne cromatografiche (una colonna a fase inversa HSS T3 e una colonna a fase polare ACQUITY BEH HILIC). Per ciascuna colonna sono state impiegate due diverse modalità di ionizzazione (in positivo e in negativo). I dati ottenuti dall’analisi LC-MS sono stati elaborati con il software MarkerLynx e sottoposti a statistica multivariata. Le variabili emerse dall’analisi statistica sono state poi confrontate con quelle presenti nei database disponibili in rete. Per quanto riguarda l’approccio target, questo è stato applicato allo studio del metabolismo degli acidi grassi nella beta ossidazione. Sono stati arruolati 157 neonati e sono stati suddivisi in quattro gruppi a seconda della settimana gestazionale (SG): gruppo 1 (22-27+6 SG); gruppo 2 (28-31+6 SG); gruppo 3 (32-36+6 SG); gruppo 4 (37-41+6 SG). Tra le 48 e le 72 ore dalla nascita da ogni soggetto sono stati raccolti un campione di plasma e uno di sangue intero sotto forma di DBS (spot di sangue su carta bibula). Per l’analisi sono state utilizzate delle acilcarnitine non marcate donate dal Dott. Piero Rinaldo (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) e dei composti marcati con isotopi stabili, acquistati da ChromSystems Instruments & Chemicals (Monaco, Germania) che sono stati utilizzati come standard interni. Acetonitrile, metanolo, n-butanolo sono stati acquistati da Carlo Erba (Milano, Italia); acido trifluoroacetico (TFA) e cloruro di acetile da Sigma-Aldrich (Milano, Italia). Tutti i solventi erano di purezza cromatografica. Per quantificare le acilcarnitine sono state costruite delle curve di calibrazione per ciascuna di esse usando il metodo delle diluizioni isotopiche. L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando i pacchetti software STATISTICA 6.0 (Stat Soft Inc, Tulsa, USA) e SPSS per Windows (versione 21.0, IBM Corp., Armonk, NY). RISULTATI Nello studio relativo all’allergia alimentare si sono ottenuti 4 set di dati (derivanti dall'uso combinato di 2 modalità di ionizzazione e di 2 diverse colonne cromatografiche), per ciascuno dei quali è stato possibile elaborare un modello robusto in grado di discriminare tra i soggetti con test di provocazione orale positivo e quelli con test negativo. Nello specifico, 4 variabili sono emerse come particolarmente significative nella differenziazione tra i due gruppi. Sebbene il confronto delle caratteristiche chimico-fisiche di queste variabili con i database metabolomici, non abbia permesso di identificare l’esatta natura delle variabili stesse, è rilevante sottolineare come utilizzando 2 delle variabili più importanti identificate sia possibile creare un albero decisionale. Lo studio relativo alla previsione di parto pre-termine e sviluppo di BPD a partire dall’analisi dei liquidi amniotici ha portato allo sviluppo di due data set. L’analisi dei due data set ottenuti (uno per ciascuna modalità di ionizzazione applicata nell’analisi spettroscopica) ha permesso di costruire due robusti modelli di PLS-DA (Partial Least Square regression-Discriminant Analysis) (R2=0.78 and Q2=0.56; R2=0.80 e Q2=0.56), in grado di discriminare chiaramente i campioni di liquido amniotico appartenenti alle 3 classi oggetto di studio (A,B,C). Una preliminare analisi dei dati mediante PCA (Principal Component Analysis) aveva consentito di escludere che tale discriminazione potesse essere dovuta al ruolo confondente di alcune importanti variabili cliniche (età materna al momento del prelievo, epoca gestazionale e terapia assunta dalla madre in gravidanza). Infine, per lo studio riguardante le acilcarnitine e gli amminoacidi, i risultati riportati definiscono gli intervalli di normalità delle concentrazioni dei componenti del pool della carnitina, compresi metaboliti isomeri e isobari, in campioni di plasma e DBS, per neonati di diverse età gestazionali. I valori ottenuti dall’analisi dei campioni non si distribuiscono secondo una gaussiana, quindi per ogni gruppo (G1, G2, G3, G4) sono stati calcolati mediane e percentili (10°, 25°, 75°, 90°) delle concentrazioni di ciascun metabolita. È stata inoltre effettuata l’analisi statistica delle differenze fra i vari gruppi. CONCLUSIONE I due studi untarget hanno dimostrato che l’analisi metabolomica è in grado di predire la risposta al test di provocazione orale con latte a partire dal profilo metabolico urinario e il parto pre-termine associato o meno allo sviluppo di BPD sulla base invece dei profili del liquido amniotico. Nello specifico, nel caso dell’allergia alimentare, 4 variabili sono emerse come particolarmente significative nella differenziazione tra i due gruppi. Sebbene il confronto delle caratteristiche chimico-fisiche di queste variabili con i database metabolomici non ha permesso di identificare l’esatta natura delle variabili stesse, è rilevante sottolineare come utilizzando 2 delle variabili più importanti identificate sia possibile creare un albero decisionale che consente la corretta predizione della risposta al test in tutti i soggetti coinvolti eccetto uno. Tuttavia, anche a prescindere dalla completa identificazione dei metaboliti coinvolti, il dato rilevante è rappresentato dall’esistenza di un “fingerprinting metabolico” in grado di individuare preventivamente i bambini più a rischio di avere una risposta positiva al test di provocazione orale con alimenti. Lo sviluppo e la validazione di tale metodica permetterà di evitare di sottoporre al test di provocazione orale i bambini con alta probabilità di sviluppare una reazione allergica (sistemica) generalizzata. Lo studio condotto sui liquidi amniotici ha dimostrato che il profilo metabolico del liquido amniotico raccolto tra la 21a e 28a settimana di gravidanza può discriminare le gravidanze associate a parto pretermine da quelle associate a parto a termine, e identificare i neonati che svilupperanno BPD. Questi risultati supportano l’ipotesi che alcune alterazioni metaboliche prenatali possano giocare un ruolo chiave nella nascita pretermine e nello sviluppo di BPD nel neonato. Tuttavia, sono necessari successivi studi per confermare questi dati preliminari e per chiarire l’interazione tra l’ambiente materno-fetale e lo sviluppo di BPD nel neonato. I risultati ottenuti dall'analisi del profilo delle acilcarnitine e degli amminoacidi confermano la necessità di definire specifici intervalli di normalità per ogni matrice utilizzata e per ogni gruppo di diversa età gestazionale, inoltre il confronto con i risultati ottenuti da altri autori fa emergere l’importanza che ogni laboratorio disponga di propri valori di riferimento, sia ai fini diagnostici che di ricerca. L’utilizzo del metodo UPLC-MS/MS ha consentito un’analisi rapida e completa del pool della carnitina nel neonato a termine e pretermine, permettendo per la prima volta l’analisi simultanea di oltre 40 acilcarnitine, comprese alcune forme isomeriche e isobare. Tali caratteristiche, unitamente ai risultati ottenuti, ne confermano il possibile utilizzo a scopo diagnostico, ad esempio come estensione dello screening neonatale/test di secondo livello